腸球菌溶血素的表型及基因型檢測

【摘要】  目的觀察大鼠全腦照射後海馬區腫瘤壞死因子α（TNFα）的動態表達，探討其在放射性腦損傷急性期的反應發病機理中可能的作用。方法製備大鼠的腦放射誘導損傷模型。利用逆轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）技術半定量分析大鼠腦放射誘導損傷後海馬區在不同時間、不同劑量水平TNFα基因轉錄的動態表達。結果正常組海馬區TNFα mRNA低水平表達；全腦照射組表達上調並在1 h達峰值，是正常組的4～11倍（P<0.001）；放射誘導呈劑量依賴性（P<0.01），30 Gy組較2 Gy組增高近2倍（P<0.001），較15 Gy組增高近1倍（P<0.01），15 Gy組也高於2 Gy組；各照射組在12 h後恢複到基礎水平。結論大鼠全腦照射後海馬區TNFα基因表達上調，放射誘導呈劑量依賴性，提示參與了腦放射誘導損傷急性期的細胞反應。

【關鍵詞】  腫瘤壞死因子α 腦損傷 海馬 疾病模型 動物

    放射性腦損傷是頭頸部腫瘤提高放射治療療效的重要障礙之一，一些亞急性期和晚期並發症的影像學和組織學變化已比較明確，但急性期的細胞和分子反應以及如何進展為晚期損傷的機理目前尚不清楚。已有實驗證實誘發腦損傷的一個重要因素是細胞因子的過度表達，損傷特征性變化如腦水腫、神經膠質增生及脫髓鞘都與前炎性細胞因子的產生密切相關[1]。腫瘤壞死因子α（TNFα）是一種典型的細胞因子，在各種損傷反應的分子網絡中都有重要作用，如在腦放射誘導損傷各反應期都可觀察到與其它細胞因子不同的變化[2]。筆者觀察大鼠腦放射誘導損傷後海馬區TNFα mRNA的動態表達，探討其在放射性腦損傷早期的反應機製中可能的作用。

    1材料與方法

    1.1動物

    1.1.1模型製作6～8周齡SD雌性大鼠100隻由廈門大學動物中心提供[動物合格證號為SCXK（滬）20040005]，體質量(200±20)g。腦放射誘導損傷模型參照文獻[3]製作。3.6%水合氯醛按1 mL/100 g麻醉，予直線加速器4 MeV電子線全腦照射，照射範圍包括雙眼至耳根區域。

    1.1.2分組按不同單次照射劑量2，15，30 Gy和照射後不同觀察時間1，6，12，24，48 h和7 d分為18組，另設假照射組（麻醉後不進行照射）和正常組（不麻醉不照射）為對照，共計20組，每組5隻。斷頭處死後隨機取一側海馬，立即置於無RNA酶的Ep管中，-196 ℃液氮保存。

    1.2方法

    1.2.1總RNA的提取按說明書用Trizol試劑(上海生物工程公司)提取總RNA。經紫外分光光度計測定D（260 nm）/D（280 nm）在1.7～2.0，計算總RNA含量，電泳證實18 S和28 S條帶清晰。

    1.2.2逆轉錄合成cDNARNA 2 μg以Oligo(dT)18為引物，20 μL反應體係在70 ℃預變性5 min；再加入5×RT buffer、dNTP、RNasin和MMLV共40 μL，體係在37 ℃反應45 min。

    1.2.3PCR擴增取cDNA 5 μL用於擴增。50 μL反應體係中加入10×buffer、MgCl2、dNTP、TaqDNA聚合酶、正義和反義引物。PCR的反應條件為94 ℃ 30 s→60 ℃ 30 s→72 ℃ 60 s，共33個循環。以βactin為內參照，擴增產物7.5 μL和βactin 5 μL混合在1.5%瓊脂糖凝膠電泳。結果采用計算機數字掃描密度影像分析儀進行半定量分析。PCR所采用的引物根據Genebank及軟件設計,由上海生物工程公司合成。序列如下：

    TNFα（438 bp）：

    F：5′GGT GAT CGG TCC CAA CAA GG3’

    R：5′CCT CCC AGG TAC ATG GGC TC3’

    βactin （332 bp）：

    F：5′CTG GAG AAG AGC TAT GAG C3’

    R：5′AGG ATA GAG CCA CCA ATC C3’

1.3統計學處理以內參照βactin光密度值標化TNFα光密度值，得到TNFα的相對含量，結果用x±s表示。應用SPSS 11.0軟件進行統計分析。對時間和照射劑量作雙因素F檢驗，對有顯著差異組樣本均數作t檢驗。

2結果

    全腦照射前海馬區TNFα mRNA表達維持在低水平，照射後基因表達上調（P<0.001），隨照射劑量的增加而增高（P<0.001），在1 h達高峰，是正常組的4～11倍，6 h仍顯著高於正常，12 h後表達均恢複到基礎水平，在7 d內未見再次上升；在6 h時間點15 Gy組數值較2 Gy和30 Gy組低，差別有統計學意義。照射組與正常組、假照射組比較，結果相同，提示麻醉不影響實驗結果（圖1，表1）。 表1大鼠全腦照射後海馬區TNFα表達

    3討論

    大腦腫瘤的放射治療可能會伴隨發生亞急性和晚期並發症的危險，其病理特征是脫髓鞘、神經元缺失、脈管係統損害和神經膠質增生。並發症的程度因照射劑量、靶體積、人種和其他因素的不同而不同。盡管這些並發症在照射後需要一定的時間才有表現，但在無症狀期觀察到的細胞反應可能對決定這種最終結果發揮重要作用[2,4]。動物模型顯示放射可以誘發腦內周期性的細胞級聯變化，包括持續數天至數月的神經膠質增生、導致脫髓鞘變化的少突膠質細胞缺失及血腦屏障損害,這些變化都與前炎性細胞因子的產生密切相關[1]。TNFα作為一種重要的前炎性細胞因子在上述條件下均可觀察到明顯的變化，故目前一致認為它參與了損傷與修複過程[5]。

    已有的文獻資料認為，鼠腦放射的平均致死劑量（LD50）為32.4 Gy[1]，而在腦腫瘤立體定向放射治療中也經常應用此範圍的單次劑量。本實驗選擇2，15，30 Gy 3個不同的劑量點也是基於此考慮。結果顯示，照射前海馬區TNFα基因表達維持在低水平，照射後表達上調，峰值在照射後1 h，是正常組的4～11倍，6 h表達仍顯著高於正常，12 h後恢複到基礎水平；水合氯醛麻醉處理並不增加TNFα的表達。盡管在6 h時間點15 Gy組數值較2 Gy和30 Gy組低，差別有統計學意義，提示仍有劑量依賴性，可能為實驗誤差。文獻報道腦放射誘導損傷後細胞因子上升峰值時間在2～8 h，24 h後恢複正常[46]。而本實驗的峰值時間和恢複時間都較之提前，可能與腦照射體積擴大、損傷加重和修複加快有關。Chiang等的結果顯示，即使低劑量輻射條件下也可觀察到TNFα、IL1基因表達上調及蛋白含量升高[6]。Hong等報道腦放射誘導損傷後急性期前炎性細胞因子基因表達增高，峰值在4，24 h後恢複，這種變化可被皮質激素抑製[4]。

    很多假說認為，大腦在受到電離輻射後過度表達的細胞因子和免疫調節分子可能參與了血管通透性增高、細胞毒性、星形細胞增生和神經膠質增殖的變化[45]。TNFα作為一種典型的前炎性細胞因子，由單核細胞、巨噬細胞、淋巴細胞、中性粒細胞和巨細胞刺激後產生，但近來發現星形細胞、小膠質細胞和神經元也是來源之一[3，6]。TNFα在低水平表達時作為免疫係統的中間介質保護宿主免於各種感染和癌細胞的攻擊，通過凋亡機製誘導癌細胞發生程序化死亡[7]，保護神經元免於興奮性氨基酸的毒性[8]。而在表達增高時TNFα則表現出明顯的致病效應，在各種損傷刺激的分子網絡中TNFα均是一個重要的細胞因子，其表達水平的上調將誘發更廣泛的分子級聯反應，如誘導IL1、IL6和ICAM1的表達，最終引起臨床症狀[910]。筆者實驗中討論的是單次劑量照射條件下的分子變化，至於分次照射的反應，已有學者報道首次照射將誘發腦細胞發生脫敏效應，不應期的存在使得間隔24 h後的放射誘導損傷較前一次明顯減輕[11]。

全腦照射後海馬區TNFα的表達明顯增加並很快達峰值，隨劑量增加而增高，24 h內恢複正常。筆者認為TNFα參與了放射性腦損傷的進程，如果能了解損傷急性期的分子機製並加以幹預，無論是對減輕治療反應還是預防晚期並發症都是有益的。

 作者：強華 劉光英 李能《福建醫科大學學報》

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