溶血性、非溶血性腸球菌的毒力差異

摘要:目的 探討腸球菌溶血素與毒力的關係。方法  比較溶血性腸球菌在臨床標本及健康人群糞便標本的檢出率;比較溶血性、非溶血性腸球菌對小鼠的LD50及其對9種抗生素的敏感性。結果 臨床標本腸球菌的溶血素檢出率61.5%,高於健康人群糞便標本(18.4%,P<0.05);溶血性腸球菌的LD50[(3.9~11)×108cfu/mL]比非溶血性腸球菌小[(2.5~8.9)×10¹⁰cfu/mL,P<0.01]。除丁胺卡那、萬古黴素外，溶血性腸球菌對抗生素的耐藥性明顯高於非溶血株。結論  腸球菌的溶血素可能與其毒力有關。

　　關鍵詞:腸球菌屬; 溶血素類; 毒力; 藥物耐受性

　　　ABSTRACT: Objective To investigate the relation between enterococcus hemolysin and its virulence.

 Methods：Incidence of hemolysin of enterococci derived from clinical isolates and healthy people fecal specimens were examined respectively; LD50 and antibiotic susceptibilities were compared between hemolytic strains and non hemolytic strains. Results　Strains derived from clinical isolates exhibited higher(61.5%) incidence of hemolysin than that from healthy people fecal speciments(18.4%, P<0.05). The LD50 of hemolytic strains [(3.9~11) 108cfu/mL] were at least 10fold higher than those of nonhemolytic strains[(2.5~8.9) 1010cfu/mL], P<0.01. Hemolytic strains were found to be more resistant to all the 9 antibiotics tested, except amikacin and vancomycin. Conclusion These results implied that hemolysin may contribute to the virulence of enterococci.

　　KEY WORDS: enterococcus; hemolysins; virulence; drug tolerance

　　腸球菌已成為院內感染的第二位主要原因[13],其致病因子的研究十分迫切與重要。有研究表明,腸球菌溶血素在眼內炎、心內膜炎、腹膜炎等動物模型中有致病作用[46]。筆者比較溶血性腸球菌、非溶血性腸球菌對小鼠的LD50及其對抗生素的敏感性,通過醫院臨床標本以及健康人群糞便標本腸球菌溶血素的檢出率調查,探討溶血性、非溶血性腸球菌的毒力差異以及溶血素在腸球菌的毒力作用。

　　1 材料與方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 菌株

　　1.1.1.1 腸球菌菌株      

　　臨床菌株分離自福建醫科大學附屬協和醫院及福建省立醫院就診患者的尿液、膽汁、腹腔液和心瓣膜、白帶、前列腺等臨床標本,健康人群菌株分離自某宿舍區健康自願者、福建醫科大學教職工、學生等糞便標本。

　　1.1.1.2 質控菌株       

　　藥敏質控菌:腸球菌ATCC29212(敏感株)、腸球菌ATCC51299(耐藥株)、金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希氏菌ATCC25922(衛生部藥品生物製品檢定所)。溶血對照乙型鏈球菌Bd1、甲型鏈球菌Bc3為福建醫科大學病原生物學係保存菌株。

　　1.1.2 動物 

　　出生4周昆明種小鼠,體質量(19±1)g,雄性,清潔級(閩實動質準第00205),福建醫科大學實驗動物中心提供。

　　1.1.3  培養基

　　1.1.3.1  腸球菌培養基ELB1       

LB培養基(1％胰蛋白腖,0.5％酵母提取物,1％NaCl)添加0.4%Na2HPO4,0.2%葡萄糖,0.8%枸櫞酸鈉,pH 7.6~7.8。

1.1.3.2 糞便分離腸球菌選擇培養基ELB2ELB1培養基添加5%NaCl,0.05%結晶紫,20 U/mL卡那黴素,pH 7.6~7.8。

　　1.1.4 cylA引物       

　　擴增片段範圍544~1024 bp(日本Takara公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 腸球菌鑒定

　　參照文獻[7]方法。

　　1.2.2 腸球菌溶血素檢測       

　　表型測定:待測菌接種於ELB1肉湯,37 ℃培養過夜,將培養液劃線分離接種到5%兔血平板,37 ℃培養36 h,出現透明β溶血環為溶血表型陽性,並用甲型鏈球菌Bc3、乙型鏈球菌Bd1做а、β溶血對照。基因型測定:以cylA引物擴增544~1024 bp的cylA片段,PCR產物經1.0％瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙啶染色,480 bp位置出現相應條帶為基因型陽性。表型及基因型均陽性為溶血性腸球菌,表型及基因型均陰性為非溶血性腸球菌。
               
　　PCR反應體係(μL):ExTaq預混液12.5;上遊引物F 1.0;下遊引物R 1.0;菌液上清1.0;高壓滅菌水9.5;總計25.0。PCR反應程序:94 ℃ 3 min→(94 ℃ 30 s→56 ℃ 30 s→72 ℃ 60 s)×30→72 ℃ 7 min。

　　1.2.3  LD50測定       

　　選取溶血性、非溶血性腸球菌各8株,分別接種於ELB肉湯,37 ℃培養48 h,取培養物5000 r/min離心5 min,PBS洗3次,用無菌生理鹽水調節濃度至1×1011,1×1010,1×109, 1×108和1×107cfu/mL 5個稀釋度。腹腔注射小鼠,每種濃度5隻,每隻0.5 mL。連續觀察7 d,記錄死亡情況。Karber法計算LD50[8]。

　　1.2.4  抗生素藥敏實驗       

　　美國臨床實驗室標準化委員會推薦的常規藥物紙片擴散法,並用質控菌為對照。

　　1.3 統計學處理       

　　臨床標本、健康人群糞便標本的腸球菌溶血素檢出率的比較、溶血性腸球菌、非溶血性腸球菌的耐藥性分析均采用χ2檢驗,溶血性腸球菌、非溶血性腸球菌對小鼠的LD50分析采用t檢驗。

　　2 結果

　　2.1 腸球菌溶血素的檢出率       

　　對90株臨床標本、40株健康人標本的腸球菌同時進行溶血素表型及基因型的檢測(PCR擴增544~1024 bp的cylA片段,圖1),對其中表型與基因型相符合的116株腸球菌進行溶血素檢出率統計,結果見表1(χ2=11.17,P<0.05)。表1 臨床及健康人標本來源的腸球菌溶血素檢出率（略）

　　2.2 溶血性、非溶血性腸球菌對小鼠的LD50      

　　8株溶血性腸球菌的LD50(3.9~11)×108cfu/mL,8株非溶血性腸球菌中6株LD50(2.5~8.9)×1010cfu/mL,2株>10×1010 cfu/mL。非溶血性腸球菌的LD50比溶血性腸球菌至少高10倍(P<0.01),溶血性腸球菌的毒力比非溶血性腸球菌強。

　　2.3 溶血性、非溶血性腸球菌對抗生素的敏感性       

　　紙片法檢測44株溶血性、40株非溶血性腸球菌對9種抗生素的敏感性。除丁胺卡那、萬古黴素外,溶血性腸球菌對其他幾種抗生素的耐藥性均高於非溶血性腸球菌,經χ2檢驗,差別有統計學意義(表2)。表2溶血性腸球菌、非溶血性腸球菌對抗生素的耐藥率（略）

　　3 討 論

　　3.1　腸球菌溶血素的檢測       

腸球菌溶血素表型的檢測可因紅細胞來源、紅細胞新鮮度、紅細胞濃度、血平板厚度以及培養時間等因素的影響,結果差異較大,α、β溶血有時並不好區分。為提高溶血素檢出的準確性,筆者同時檢測腸球菌溶血素基因。腸球菌溶血素基因大約7 kb,由cylA、B、L、M、I、R等組分組成。其中cylA片段高度保守,因此選用該基因片段進行PCR檢測診斷,發現部分攜帶cylA基因的腸球菌並未出現相應的β溶血素表型,提示致病基因可能在某些條件下處於沉默狀態。Eaton等認為這可能是由於基因操縱子部分缺失,或者致病基因隻在體內環境表達[910]。筆者對腸球菌溶血素同時進行表型及基因型檢測,對二者相符的菌株進行溶血素檢出率統計,提高腸球菌溶血素檢出的準確性。

3.2 溶血性、非溶血性腸球菌的毒力差異       

　　實驗結果表明,臨床標本中腸球菌溶血素的檢出率高於健康人群糞便標本,說明腸球菌溶血素在臨床感染中起一定作用,具備毒力因子的特征。進一步比較溶血性腸球菌與非溶血性腸球菌對小鼠的LD50,由於腸球菌是正常菌群,毒力較弱,LD50值較高,但是二者對小鼠LD50有差別,所有溶血性腸球菌的LD50比非溶血性腸球菌至少低10倍,說明溶血素在腸球菌中具有毒力作用。實驗結果表明溶血性菌對抗生素的耐藥率高於非溶血性菌,這也從一定程度體現了腸球菌溶血素的毒力作用。因為毒力株(溶血株)常在抗生素的治療環境中,承受更大的抗生素選擇壓力,導致耐藥率更高。也有人認為腸球菌的溶血素對細胞壁的降解作用可使抑製細胞壁生長的抗菌素失去作用,引起耐藥[11]。

　　3.3 腸球菌的毒力與耐藥性       

溶血性菌株、非溶血性菌株對丁胺卡那黴素、萬古黴素耐藥率沒有明顯差別,可能原因:(1)有些腸球菌對磺胺、卡那黴素等抗生素呈現固有耐藥;(2)目前福州地區腸球菌菌株對萬古黴素耐藥率還較低,導致統計學處理無顯著性。
               
　　本研究中腸球菌溶血性菌株的耐藥性比非溶血性溶血菌株嚴重,這一現象提示腸球菌致病性與耐藥性之間或許還存在某些聯係。腸球菌的溶血素及藥物抗性可由質粒、轉座子等所編碼,因此一些編碼溶血素或藥物抗性的基因可因接合、轉座等相互播散或連鎖,加劇了腸球菌的致病性與耐藥性,給防治帶來困難,對此應予以關注。

作者：強華, 謝曼淩《福建醫科大學學報》

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