1材料和方法
1.1材料限製性核酸內切酶，T4DNAligase購自New England Biolab公司. 厭氧發生劑、腦心浸液(幹粉)購自生物梅裏埃公司(bioMerieux). 其他試劑為國產分析純. 艱難梭菌（clostridium difficile, C.d VPI10463）從蘭州生物製品研究所購買. 大腸杆菌菌株BL21(DE3)及質粒PET22b(+)係南方醫科大學消化研究所存.
1.2方法
1.2.1目的基因的獲得C.d VPI 10463接種於腦心浸液(BHI)培養基中，37℃厭氧環境中透析培養72 h. 堿裂解法提取C.d基因組DNA. 參考Gene bank收錄的C.d VPI 10463基因序列，設計引物如：sense: 5′TCCGAATTCG CTTATGTCAACTAGTGAA3′ EcoRI, antisense: 5′GCACTCGAGTTCACTAATCACTAATTG3′， XhoI. 反應條件：50 μL反應體係，熱啟動法，94℃變性45 s, 60℃退火60 s, 72℃延伸150 s, 39個循環後再延伸10 min. 10 g/L糖凝膠電泳觀察擴增結果.
1.2.2重組質粒的構建與鑒定將酶切、純化的目的基因、質粒PET22b(+)按10∶1(摩爾數) 在T4DNAligase作用下16℃連接12 h. 熱休克法轉化. 挑單個菌落，接種在選擇性LB液體培養基中，A600 nm值達0.6，提取重組質粒. 重組質粒的鑒定：用EcoRI與XhoI雙酶切鑒定；以重組質粒為模板，進行PCR反應，送上betway必威西汉姆联亞公司測序.
1.2.3目的基因表達陽性克隆菌落接種到2 mL選擇性LB培養液37℃, 180 r搖菌致A600 nm為0.6，4℃過夜，然後2%轉接LＢ培養液中，培養3 h至A600 nm值為0.8，加IPTG至終濃度為1 mmol/Ｌ，誘導後取樣. 產物進行SDSPAGE分析.
2結果
2.1PCR擴增的目的基因電泳分析發現在1800 bp左右有一條帶，大小與預計相符(圖1).
圖1瓊脂糖凝膠電泳分析ＰＣＲ產物 略
2.2重組質粒的鑒定將獲得重組質粒命名為PET22b(+)CDB3，電泳初步鑒定結果與預期相符（圖2）. 直接以PET22b(+)CDB3為模板進行測序,得到的ＤＮＡ序列，與Gene bank記錄的C.d VPI10463的ToxinB3基因序列的同源性為99%.
圖2目的基因的PCR產物、重組質粒和PET22b（+）載體用EcoRI單酶切的圖譜 略
2.3重組蛋白的誘導表達經IPTG誘導後,120 g/L SDS PAGE分析表明,含有PET22b(+)CDB3宿主菌表達出Mr約為71.3×103，與預期的蛋白大小相符，含質粒pET 22b(+)及無質粒的細菌則無此特異條帶. 在A600 nm值為0.8，IPTG終濃度為1 mmol/L，誘導4 h時，重組蛋白的表達量最大，以可溶性蛋白為主，便於純化. 凝膠自動掃描分析,其PET22b(+)CDB3重組蛋白占細菌周質總蛋白的34%,可溶性表達占上清的22.7%，包涵體占沉澱的25.7% (圖3).
圖3CDB3基因誘導表達產物的SDSPAGE分析 略
3討論
C.d是腸道感染中僅次於彎曲杆菌的常見致病菌，產生的毒素A與毒素B對人體造成危害，被公認為發達國家中最重要的院內感染源之一［1］. 雖然口服甲硝唑或萬古黴素治療可取得較好的療效，但目前已存在耐藥及停藥後複發等問題. 疫苗接種可使高危人群獲得持久和較強的免疫力，是預防與控製感染的有效措施［2］. C.d重組抗原的研究已見較多的報道，但多數是集中在毒素A上［3］，而對毒素B的研究則相對較少. Genth等［4］的研究將毒素B分成3個氨基酸片段：CDB1（氨基酸1546），CDB2（氨基酸 9011750），CDB3（氨基酸17512366），發現抗毒素B抗體與CDB3可以發生強烈反應，抗C.d抗體既與CDB1又能與CDB3 反應，CDB2則與兩抗體均不反應. 說明CDB3是良好的抗原. 進一步實驗發現，隻有抗CDB3抗體才能保護完整細胞免受毒素B的細胞毒性，而抗CDB1抗體隻有進入細胞內才能起保護作用 . 說明該段很有可能成為製備疫苗和診斷抗原的重要候選蛋白. 故選取了毒素B羧基末端CDB3 (氨基酸17512366)進行表達，為以後的疫苗和抗原鑒定的研究建立基礎.
本研究參考C.d國際標準株VPI 10463基因序列，用自行設計的CDB3引物在PCR反應中表現出較高的特異性，為理想的引物序列. 在上、下遊引物中分別加入EcoRI與XhoI酶切位點，保證了讀碼方向的正確性. 為便於下一步的表達和純化工作又將其裝入了末端帶有His標簽的融合表達載體，酶切鑒定和測序結果顯示獲得了帶有特異的CDB3基因. 蛋白電泳分析表明獲得了高效表達的C.d ToxinB3克隆株，本實驗所表達的蛋白，與該基因編碼的蛋白的分子質量大小是一致的，更進一步驗證了克隆的目的基因的正確性. 因此,本研究為研製C.d重組疫苗及製備診斷試劑 奠定了一定的基礎.
作者：劉紅升，張清華，薑泊，蔣知新《中國生物製品學雜誌》
【參考文獻】 （略）
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