細胞培養中細菌類微生物汙染的快速檢測

［摘 要］ 目的  檢測細胞培養中細菌類（包括支原體）微生物的汙染情況。 方法  用細胞培養中常見的培養物人為汙染He-La細胞，設計細菌類微生物16S rRNA基因序列通用引物，PCR擴增16S rRNA基因序列片斷，建立PCR檢測培養細胞汙染的方法，並用該方法檢測本室保存的細胞株的汙染情況。結果  人為汙染綠膿杆菌、大腸杆菌、白色葡萄球菌和支原體M.fermentans的Hela細胞的培養上清中均擴增出大小的片段，與目的片段相符。本室所收藏的15個細胞株有3株的培養上清中擴增出大小的片段。 結論  本實驗建立了16S rRNA基因序列通用引物PCR法，可用於快速檢測培養細胞中細菌類微生物的汙染。      

　　［關鍵詞］ 細胞培養;細菌;汙染;PCR      

　　Rapid detection of bacterial or microbial contamination in cell cultures

           

　　Abstract:Objective To investigate a fast and simple method to detect bacterial contaminations including Mycoplasma contamination in cell cultures.Methods HeLa cells were used for propagation P.aeruginosa，E.coli，S.epidermidis and M.fermentans，respectively.The suit-ability of PCR based on the universal primers for the16S rRNA gene sequences of prokaryotic cells for the detection of bacterial contamination in He-La cell cultures was investigated.Then this method was used to test15cell strains in our laboratory.Results Nearly1500bp region was amplified from all of the HeLa cell cultures contaminated by P.aeruginosa，E.coli，S.epidermidis or M.fermentans.Of the15cell strains in our labora-tory，3were tested positive using this method.Conclusion The PCR method based on the universal primers for the16S rRNA region of prokaryotic cells might be used for the rapid detection of bacteria in cell cultures.

     

　　Keywords:cell culture;bacteria;contamination;PCR

      

　　細胞培養被微生物汙染，是常見而又嚴重影響細胞培養後續研究工作的問題。微生物汙染包括真菌類，細菌類（包括支原體）以及病毒類對培養物的汙染。其中真菌汙染後不難被發現，而病毒汙染的檢測應根據不同的病毒選用不同的方法，而且需要建立相應的參照係統，屬於病毒學範疇，在普通實驗室不易推廣。細菌類微生物，特別是某些細菌和支原體汙染後，對培養液無肉眼可見影響，是細胞培養中最常見，不易被察覺又幹擾實驗結果的問題［1-5］ 。因此，檢測並消除細菌類微生物汙染在細胞培養工作中至關重要。PCR技術用於檢測培養物中支原體汙染的研究已有報道［1-4］ ，但由於培養物的DNA提取以及PCR技術本身要求的實驗條件及成本較高，在普通實驗室不易推廣;設計的引物如果不能涵蓋所有的支原體種也容易造成檢測標本的假陰性［3］。本實驗采用煮沸法粗提DNA，合成細菌類16S rRNA特異性序列通用引物，用PCR擴增法對培養物進行檢測，真正做到廉價、靈敏、簡便和快速。而且早期即可以檢測到細胞培養中細菌類微生物的汙染，對於汙染後的挽救也有重要意義。

    

　　1 材料與方法

　　1.1 細菌參考株      

　　綠膿杆菌、大腸杆菌、白色葡萄球菌，由本室保存;支原體M.fermentans等，由北京軍事醫學科學院溫博海教授惠贈。

　　1.2 細胞株    

　　無支原體汙染的HeLa細胞，由保井孝太郎教授惠贈。作為陰性對照和實驗室人為汙染的細胞樣品。本室所收藏的細胞係共15個細胞株。    

　　1.3 實驗室人為汙染HeLa細胞    

　　分別刮取各種常見細菌冰晶，接種於LB培養基，支原體接種於牛心浸液，37℃過夜培養。取50μl上述培養物接種於新傳代的HeLa細胞，共同培養。    

　　1.4 細菌基因組DNA的煮沸法小量製備    

　　取各個感染組的培養上清，12000r.min離心30s，棄上清後加入200μl PBS重懸，將重懸液於沸水（100℃）中煮5min，12000r.min離心15min，吸出上清移入一個新的EP管中，加入冰預冷的異丙醇200μl，於-20℃放置15min。12000r.min離心5min，棄上清，用50μl TE緩衝液重懸。

　　1.5 PCR擴增    

　　PCR擴增細菌類16S rRNA特異性序列通用引物［6-7］ 。上遊引物（A-17）:5′-GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′;下遊引物（3-17）:5′-AAG GAG GTA ATC CAG CC-3′;擴增片段大小約1500bp。

2 結果    

　　2.1 檢測細胞培養中細菌類微生物汙染的通用性    

　　本實驗所用的引物是根據溫博海等［7］設計的原核細胞16S rRNA基因序列通用引物。人為汙染綠膿杆菌、大腸杆菌、白色葡萄球菌，以及支原體M.fermentans的Hela細胞的培養上清中均擴增出約1500bp大小的片段，與目的片段相符（圖1）。    

　　    

　　圖1 PCR方法的通用性檢測結果（略）

    

　　2.2 靈敏度檢測      

　　根據紫外分光光度計A值計算，煮沸法小量製備的細菌基因組DNA的濃度為13μg.ml，10倍係列稀釋後，分別取1μl作為模板進行PCR擴增。當模板濃度降低到52fg.ml時，在1500bp處仍可見明顯的擴增條帶（圖2）。    

　　　圖2 PCR方法的靈敏度檢測結果（略）

    

　　2.3 初步應用      

　　用上述方法檢測了本室所凍存的11個細胞係中凍存批次較早細胞（表1），其中有3個批次的培養上清中擴增出1500bp大小的片段，認為該批次的凍存細胞汙染了細菌類微生物，考慮到這些細胞係較廉價，故將該批次以及來自該批次來源的其他凍存細胞丟棄。

     　　表1 本實驗檢測的體外培養細胞株（略）

   

　　3 討論      

　　細胞培養被細菌類微生物（包括細菌和支原體）汙染，是常見而又嚴重影響細胞培養後續研究工作的問題。特別是支原體汙染，對體外培養的細胞的幾乎所有的指標及產物均有影響，而且可以不被察覺地隨著細胞的傳代而傳代［1-5］ 。早在1994年Wirth等［1］ 就利用PCR技術檢測培養物中支原體的汙染，但由於培養物的DNA提取以及PCR技術本身要求的實驗條件和成本較高，在普通實驗室不易推廣;而且設計的引物如果不能涵蓋所有的支原體種也容易造成檢測標本的假陰性［3］。所以多數實驗室寧可將懷疑有汙染的細胞丟棄，也不進行檢測。本實驗采用煮沸法粗提DNA，合成原核微生物16S rRNA特異性序列通用引物，用PCR擴增法檢測細胞培養物中是否有原核微生物的存在，建立了簡便廉價且靈敏快速的細胞培養中細菌類微生物汙染的檢測方法。   

　　本實驗采用煮沸法粗提細菌基因組DNA，成本低且簡便易於操作，當模板量降低到52fg.ml時用PCR法仍可擴增出目的條帶，說明該方法比較靈敏快速，可以在汙染的較早期迅速檢測到汙染的存在，對一些珍貴細胞的挽救非常重要。另外，16S rRNA基因序列是原核生物特有的基因序列而且比較保守，在細菌的分類中被認為是分子進化鍾［6-7］ ，本實驗利用通用引物擴增這一區段，還可以進一步測序證實汙染物的種類，以便進行有針對性的挽救。

    作者：萬穎傑，張俊磊，安靜《局解手術學雜誌》

　　［參考文獻］     

　　［1］WirthM，Berthold E，GrashoffM，et al.Detection of mycoplasma contaminations by the polymerase chain reaction［J］.Cytotechnol-ogy，1994，16（2）:67-77.

   

　　［2］王正森，吳建新，趙小元，等.用PCR檢測細胞培養中支原體汙染［J］.生物化學與生物物理進展，1994，21（6）:553-556.

   

　　［3］Uphoff CC，Drexler HG.Detection of mycoplasma contaminations in cell cultures by PCR analysis［J］.Hum Cell，1999，12（4）:229-236.   

　　［4］Uphoff CC，Drexler HG.Detecting mycoplasma contamination in cell cultures by polymerase chain reaction［J］.Methods Mol Med，2004，88:319-326.    

　　［5］ Wang H，Kong F，Jelfs P，et al.Simultaneous detection and identification of common cell culture contaminant and pathogenic mollicutes strains by reverse line blot hybridization［J］.Appl En-viron Microbiol，2004，70（3）:1483-1486.   

　　［6］Perez M，Rikihisa Y，Wen B.Ehrlichia canis-like agent isolated from a man in Venezuela:antigenic and genetic characterization［J］.J Clin Microbiol，1996，34（9）:2133-2139.   

［7］溫博海.立克次體16S rRNA基因序列分析［J］.中國人獸共患病雜誌，1999，15（6）:18-20.