細菌是一類原核細胞型微生物。因菌體小半透明,要想更清楚地觀察其大小和形態,需經染色和顯微鏡放大後才能看到。常用的細菌染色法有單染法和複染法。複染法是用兩種以上的染料染色,可將細菌染成不同顏色,除可觀察細菌的形態外還能鑒別細菌。主要有革蘭染色法、抗酸染色法、特殊染色法[1] 。筆者為了克服傳統染色方法存在的不足,將革蘭染色法、抗酸染色法、莢膜染色法、芽胞染色法等進行改良,經多年實驗教學實踐證明效果良好,報告如下。
1 材料與方法
1.1 革蘭染色法 (1)取含金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的混合菌液塗片、幹燥、固定;(2)染色:用結晶紫染液染1min,水衝洗;盧戈碘液染1min,水衝洗;0.4%複紅酒精溶液染30s,水衝洗;(3)吸幹後鏡檢[2] 。
1.2 抗酸染色法 (1)取結核杆菌陽性的痰標本(已處理)塗片、幹燥、固定。(2)染色:將石炭酸複紅染液沸水浴10min,滴加2~3滴覆蓋菌膜染色5min,水衝洗,3%鹽酸酒精脫色30s,水衝洗;堿性美蘭複染30s,水衝洗。(3)吸幹後鏡檢[3] 。
1.3 莢膜染色法 (1)取接種肺炎球菌死亡的小鼠腹腔液塗片、幹燥、固定;(2)染色:用石炭酸複紅染液染1min,水衝洗;95%酒精脫色5s水衝洗;20%鞣酸溶液媒染10min水衝洗;0.8%孔雀綠溶液染色1min,水衝洗;(3)吸幹後鏡檢[4] 。
1.4 芽胞染色法 (1)取等量破傷風杆菌厭氧培養菌液和5%孔雀綠水溶液,放入小試管中充分混合,沸水浴20min;取上述混合液塗片、幹燥、固定;(2)用1%沙黃液複染10min,水衝洗;(3)幹後鏡檢。
2 結果與討論
2.1 革蘭染色 鏡下,金黃色葡萄球菌染成紫色、球形,為革蘭陽性菌;大腸埃希菌染成紅色、杆狀,為革蘭陰性菌。革蘭染色法是細菌學中最經典,應用最廣泛的染色法之一。脫色是影響革蘭染色的關鍵步驟,脫色時間長短直接關係到染色結果的準確性[5] 。脫色過度則革蘭陽性菌可能被誤染為革蘭陰性菌,脫色不 夠則革蘭陰性菌可能被誤染為革蘭陽性菌,為此學生難以把握。現將原有四步染色法改為三步法,即把第三步酒精脫色和第四步複紅複染合並一步進行,使用0.4%複紅酒精溶液作為複染劑,可達到脫色和複染雙重目的。這樣,就可以避免學生在四步法中因脫色時間不易掌握而造成染色的失敗,減少重複性實驗,提高了教學效果。
2.2 抗酸染色 鏡下,結核分枝杆菌染成紅色,為抗酸菌;背景和其他菌被染成藍色,為非抗酸菌。傳統的方法是滴加石炭酸複紅染液於塗片上,用玻片夾夾住塗片以微火煙葉熱,保持染液冒蒸汽約5min,此法學生容易使染液蒸幹或使染液沸騰,從而影響染色效果和汙染環境。改良後的方法是將染液直接加熱改為水浴後使用,克服上述的缺點,且染色效果良好。適合實驗教學使用。
2.3 莢膜染色 鏡下,肺炎球菌菌體染成紅色(成雙排列),莢膜染成綠色,存在於菌體的周圍。傳統的莢膜染色是用結晶紫染液染色,菌體染成紫色,莢膜染成淡紫色或無色,菌體和莢膜之間反差小,不易分辨。改良後,增加了脫色、媒染、複染的步驟,使菌體和莢膜之間反差增大,易於觀察,可用於學生實驗和示教片的製作。
2.4 芽胞染色 鏡下,破傷風杆菌的菌體染成紅色,芽胞染成綠色。傳統的方法是滴加石炭酸複紅染液於塗片上並弱火加熱,使染液冒蒸汽約5min,此法染液用量大,且容易汙染衣物和實驗台。現改為菌液和染液混合水浴加熱初染,然後製備塗片、固定、複染,即節約時間,染液消耗又少,且菌體、芽胞對比鮮明。此法適用於教學標本片的製作。
作者:林君榮
作者單位:遼東學院醫學院病原微生物學教研室,《淮海醫藥》
【參考文獻】
[1] 陳興保,主編.病原生物學和免疫學[M].第5版.北京:人民衛生出版社,2005.97.
[2] 黃元桐,崔 傑.革蘭氏染色法三步法與質量控製[J].微生物學報,1996,36(1):76-78.
[3] 宋淑賢,聶 清.微生物學常用細菌染色方法的改進[J].黑龍江醫藥科學,2001,24(1):36.
[4] 苗 芳,李連誌.實驗教學中幾種細菌染色的改變方法[J].承德醫學院學報,2001,18(2):152-153.
[5] 郭積燕,主編.微生物檢驗技術[M].北京:人民衛生出版社,2002.36.
上一篇:細胞培養中細菌類微生物汙染的快速檢測
下一篇:細菌鞭毛鍍銀染色法的創新