細菌鞭毛染色法染色條件的探討

［摘要］  目的  探討不同的染色條件對細菌鞭毛染色效果影響，尋找一套適合的染色方法。方法  將37 ℃培養18～24 h的普通變形杆菌培養物，稀釋成菌懸液製片、染色，比較不同的菌懸液濃度、處理時間、染色時間和染色方法對細菌鞭毛染色效果的影響。結果  濃度為1.5×1012/L的菌懸液37 ℃放置10 min製片，用石炭酸複紅法染色10～15 min，水洗，幹燥鏡檢，其背景清晰，80%～90%的細菌有鞭毛，菌體紅色，鞭毛淡紅色，染色效果理想。結論  細菌鞭毛染色過程中菌懸液的濃度、菌懸液的處理時間、製片方法以及染色時間的長短等條件影響鞭毛染色效果。

    ［關鍵詞］  普通變形杆菌；鞭毛；染色與標記

    A STUDY OF STAINING CONDITIONS FOR BACTERIAL FLAGELLUML RUI

    (Department of Microbiology, Qingdao University Medical College, Qingdao 266021, China)

    ［ABSTRACT］ObjectiveTo study the staining of bacterial flagellum under different staining conditions and to find an appropriate way of it.MethodsThe Proteus vulgaris culture was cultured at 37 ℃ for 18-24 h, then a slide was made by the diluted suspension and stained. The staining result of bacterial flagellum under different conditions, such as the concentration and handling time of the suspension, staining time and staining methods, was compared. ResultsA slide of bacterial suspension with a concentration of 1.5×1012/L , to be placed at 37 ℃ for 10 min then stained by carbolfuchsin for 10-15 min. Under a microscope, a clear background with red thalli and faint red flagellum could be seen in 80%-90% of the bacteria.ConclusionThe concentration and handing time of suspension, slidemaking method and staining time are important factors for an ideal flagellum staining.

    ［KEY WORDS］Proteus vulgaris; flagella; staining and labeling

    細菌鞭毛染色是醫學微生物學實驗和臨床細菌學診斷中一項常用的實驗技術，通過鞭毛染色，可以觀察鞭毛的形態、數量和鞭毛在菌體分布的位置，並以此來鑒定細菌的一些重要特征［1］。然而，在細菌鞭毛染色的實際操作中往往較難取得預期的效果。經過多年的染色實踐，作者認為，染色的成功與否在很大程度上取決於對染色條件的掌握。本文就細菌鞭毛染色過程中出現的一些問題及現象進行了探討。現報告如下。

    1  材料和方法

    1.1  實驗材料

    菌種為普通變形杆菌，由我院微生物學教研室保存；普通培養基，購自北京陸橋生物製品有限公司；石炭酸複紅鞭毛染色液［2,3］，由飽和鉀明礬液2 mL、50 g/L石炭酸5 mL和200 g/L的鞣酸液2 mL混合而成，臨用時加1 mL堿性複紅乙醇飽和液；石炭酸結晶紫鞭毛染色液［3］，為飽和鉀明礬液5 mL、50 g/L石炭酸5 mL和鞣酸1 g混合而成，臨用時加1 mL結晶紫乙醇飽和液；幹淨載玻片。

    1.2  實驗方法

    1.2.1  石炭酸複紅鞭毛染色法  ①菌懸液的製備［4~6］：將普通變形杆菌接種在營養瓊脂中，37 ℃培養18～24 h，挑取培養基中遷徙生長邊緣的菌苔少許，加入盛有適量無菌蒸餾水的試管中，製成4種不同濃度的菌懸液（比濁法），分別為1.5×1012/L、3.0×1012/L、6.0×1012/L、9.0×1012/L。②菌懸液的處理：菌懸液置37 ℃溫箱孵育5、10、15、20 min。③載玻片的處理［7］：將載玻片用肥皂粉洗淨，自來水反複衝洗，蒸餾水衝洗3次，晾幹，置於無水乙醇中，過夜，備用。④製片方法：載玻片從無水乙醇中取出，直立於吸水紙上，吸去多餘的乙醇，然後將載玻片在乙醇燈火焰上經過2～3次即可使用（注意不可用手觸摸載玻片表麵）。按照文獻［7］的方法用菌懸液製片，37 ℃幹燥。⑤染色：製片幹燥後滴加鞭毛染色液數滴覆蓋有菌處，作用5、10、15 min，水洗，幹後鏡檢。

    1.2.2  石炭酸結晶紫鞭毛染色法  染色步驟同石炭酸複紅鞭毛染色法。製片幹燥後滴加石炭酸結晶1期呂銳細菌鞭毛染色法染色條件的探討81紫鞭毛染色液數滴，作用5、10、15 min，水洗，幹後鏡檢。

    2  結    果

    2.1  菌懸液濃度對細菌鞭毛染色的影響4種濃度的菌懸液中，以1.5×1012/L的菌懸液染色效果最好，菌量合適，菌體、鞭毛均清晰可見。3.0×1012/L、6.0×1012/L的菌懸液染色效果次之，菌量稍多，有些細菌鞭毛交叉重疊、發生粘連。9.0×1012/L菌懸液染色效果最差，菌量太多，有些菌體不能著色，不利於觀察。

    2.2  放置時間對細菌鞭毛染色的影響放置10 min的菌懸液製片染色效果最好，菌體、鞭毛粗細合適，清晰可見；放置5 min的菌懸液由於時間太短，鞭毛細小，染色淺，不易觀察；放置15、20 min的菌懸液由於時間太長，菌體、鞭毛均膨脹過大，而且很多鞭毛脫落，製片的效果不好。

    2.3  染色時間對細菌鞭毛染色的影響染色10、15 min的效果好，菌體、鞭毛著色深且清晰；染色5 min的菌體、鞭毛著色淺，不易觀察。

    2.4  與石炭酸結晶紫鞭毛染色法的比較

    複紅法染色80%～90%的細菌有鞭毛，菌體紅色，鞭毛淡紅色，背景清晰；結晶紫法60%～70%的細菌有鞭毛，菌體和鞭毛均呈淡紫色，背景模糊，鞭毛和染料顆粒有粘連，觀察效果不好。

    3  討    論

    鞭毛是某些細菌的一種特殊結構。因鞭毛纖細，直接在光學顯微鏡下觀察不到，必須經過特殊的鞭毛染色，增粗鞭毛直徑後再著色，才能在光學顯微鏡下看到。鞭毛染色是微生物學實驗中一項常用、不易把握、又難以達到預期效果的染色技術，由於影響染色效果的因素較多，又沒有一些量化的指標，所以很多時候都不能取得滿意的效果。本文對鞭毛染色的一些條件進行了探索，結果顯示，合適的菌懸液濃度、菌懸液的正確處理方法、製片的技術、染色時間以及不同的染色方法對鞭毛染色的成功具有非常重要的意義。菌懸液濃度過高，會使菌量過大，鞭毛交叉粘連，不利於觀察。菌懸液37 ℃處理時間過長，菌體、鞭毛膨脹過大，鞭毛脫落；處理時間過短，鞭毛纖細，不易著色。另外，載玻片要嚴格處理，不能含油脂，不可用手觸摸載玻片的表麵，不能用取菌環塗片，否則會使鞭毛脫落。在染色時間的把握上，時間過短鞭毛不著色，而時間過長鞭毛染料顆粒發生粘連。同時，本文還對兩種染色方法進行了比較，結果表明，複紅法染色後背景清晰，染料顆粒少或沒有，容易觀察，鞭毛染出百分率高；結晶紫法染色後則染料顆粒多，背景模糊，鞭毛染出百分率低。本文結果顯示，培養18～24 h的普通變形杆菌，製成濃度為1.5×1012/L的菌懸液，經37 ℃處理10 min，按照文獻［7］的製片方法製片，采用石炭酸複紅鞭毛染色法作用10～15 min，可取得滿意的染色效果，重複性也好。該方法簡單、快速，染液配製不複雜，除了可用於實驗教學外，在一些細菌學的診斷中也具有一定的意義。我們用同樣的染色條件對大腸杆菌、傷寒杆菌、銅綠假單胞杆菌、副溶血弧菌進行鞭毛染色，均取得令人滿意的結果。值得注意的是，不同菌種鞭毛的形成與溫箱中培養的時間有著密切的關係，這在文獻中已有報道［1,8］，也是在鞭毛染色中應該注意的。另外，還有其他一些染色方法如Bailey法、銀染色法、戶田法等［5,6,9］，都需要進行改良才能取得比較滿意的效果，準備工作比較繁瑣，不如本文的染色方法簡單、快速、容易掌握。因此，教學工作中采用石炭酸複紅法進行鞭毛染色，不僅節省時間，提高工作效率，而且染色效果好，值得推廣使用。

 

作者：呂銳   《青島大學醫學院院報》 （青島大學醫學院微生物學教研室，山東 青島  266021）

    ［參考文獻］

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    ［3］劉昌平，陳恩華.三種細菌鞭毛染色法比較［J］.中國微生態學雜誌，1995，7（1）：62.

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