建立一種糞便細菌學檢驗的新方法---腸道菌譜分析

[摘要］目的 建立一種以糞便標本細菌菌譜分析為主要內容的細菌學檢驗方法。方法 取糞便標本直接塗片做革蘭染色，鏡檢觀察標本中細菌數量、種類及比例，並進行顯微照相；對糞便標本進行菌群培養，分離病原菌，並與鏡檢結果進行對照；將照片進行分類，建立菌群失調和病原菌感染的圖譜。同時以正常大便菌譜作對照。結果 因菌群失調導致的腹瀉，直接鏡檢表現為細菌數量和種類普遍減少，或某一類細菌增多或減少，或呈單一種類細菌；由某種病原菌引起的腹瀉，直接塗片多數隻能見到革蘭陰性杆菌，且細菌數量少或極少，一般均與培養結果相符。結論 糞便細菌菌譜分析能直接或間接為臨床提供腹瀉患者的腸道微生態資料，尤其能準確地提示因各種原因造成菌群失調而導致的腹瀉，為臨床診斷和製定治療方案提供快捷、科學的依據。

 

 

    長期以來，糞便標本細菌學檢驗主要是以分離沙門菌屬和誌賀菌屬細菌為目的。但隨著新的腹瀉病原菌的不斷被發現以及各種因素造成菌群失調引起的腹瀉不斷增多，傳統的糞便細菌學檢驗方法和內容已不能滿足現代醫學診治的要求。我們通過建立糞便塗片細菌菌譜，對糞便標本進行病原菌分離培養，及對腸道菌菌譜的分析，為臨床提供真實可*的病因病原學診斷依據。

 

1 材料與方法

 

1.1材料

1.1.1標本來源  糞便標本568 份，均取自2003 年5-12 月來我院就診的腹瀉患者。其中門診患者54 份，住院患者484 份；男性356 份，女性212 份；< 14 歲的兒童369 人份，> 60 歲的老年人74 人份。對照糞便（性狀：軟、成形）60 份，即每做10 份標本加l 個對照。

1.1.2 培養基  5 ％羊血平皿（BA）、SS 平皿、l % 山梨醇麥康凱平皿（Mac ) ，均按標準自製。培養基幹粉、藥敏紙片、診斷藥敏紙片等購自法國梅裏埃生物有限公司；生化鑒定管購自杭州天和微生物生物試劑有限公司。

1.1.3 診斷血清  霍亂弧菌、腸致病性大腸埃希菌( EPEC）、沙門菌屬和誌賀菌屬診斷血清，均購自衛生部蘭州生物製品研究所。

1.1.4 顯微鏡（OLYMPUS)   BX41 顯微鏡及JVCTK-C1381EG 彩色攝像儀，購自朗咖生物醫學工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 塗片染色  568 份腹瀉糞便標本和60 份正常對照糞便標本均直接塗片，革蘭染色，置油鏡下鏡檢，詳細記錄各類細菌形態、大致數量及比例，並進行顯微照相，標碼後存於電腦中。對照組直接塗片鏡檢，油鏡下印象：各類細菌均有分布，數量約500-5000個/油鏡視野（嬰幼兒糞便細菌量較成人少）。革蘭陽性（G +）杆菌、革蘭陰性（G-）杆菌、G+球菌、G-球菌等4種菌的比例約為60:35:4:1，優勢菌為G +杆菌。

1.2.2 菌群培養  取每份糞便標本分別接種營養平皿做4 區劃線（評估菌量），置36 ℃ 溫箱24,48,72h 後觀察細菌（需氧菌）在營養平皿4 區上的生長情況。用打加號的方法記錄細菌的生長量，即4個劃線區都有菌（每一區菌落數≥10 個，下同）打4 + ; l,2,3 劃線區有菌打3 +; l、2 區有菌打2+; 1 區有菌打l +。同時觀察細菌在此培養基上的形態特征及各菌種間的比例，必要時挑取可疑菌落做革蘭染色，以便對菌譜分析結果作出初步判斷。對照組菌群培養：4 個劃線區菌量豐富可打4＋。平皿上菌落較純，為G-杆菌（未作厭氧培養）。

1.2.3 分離培養  各取一環標本分別接種BA , SS , Mac3 種培養基，36 ℃ 培養24 , 48 , 72h ，記錄細菌在各種培養基上的生長情況，挑取可疑菌落（無色透明不發酵乳糖或遲緩發酵乳糖菌落）進行菌種鑒定。對照組分離培養：上述培養基上均未見到可疑菌落。

1.2.4 血清學鑒定  對疑似致病性大腸埃希菌菌落用EPEC 抗血清做凝集試驗；對疑似霍亂弧菌、沙門菌、誌賀菌菌落分別用相應的抗血清做凝集試驗。

1.2.5 藥敏試驗  對檢出的致瀉菌按照美國臨床實驗室標準化委員會（NCCLS）的要求，采用K-B 法做藥敏試驗。

 

2 結果

 

2.1  糞便標本革蘭染色鏡檢  其菌群象大致分為以下幾種類型。（l）成形、軟的正常糞便菌群象：一般是細菌量豐富，G+菌與G-菌比例恰當，細菌的形態呈現多樣性，優勢菌為G+杆菌。（2）粘液樣膿血便菌群象：多數隻見到G-杆菌，細菌量少或極少。（3）稀糊樣便菌群象：正常與異常菌群象並存（因為嬰幼兒糞便多以稀糊樣便為主），以G+球菌為主者，成雙、成鏈或成堆排列；有部分菌群象中可見到多量或少量真菌抱子及菌絲；以G-杆菌為主者細菌常呈多形性，而培養細菌種類比較單一。（4) 水樣稀便菌群象：有相當一部分菌量稀少，或者單獨以G+球菌或G-杆菌或真菌為優勢菌，有些標本甚至觀察不到細菌。各類菌群象見彩圖1-9 （插頁）, 塗片染色鏡檢片印象見表l 。

2.2  菌群培養  分別於24 , 48 , 72h 觀察4 區劃線的營養平皿。成形軟便標本經過培養，4 區菌落都很豐富，可打4 +（且基本以為G-杆菌為主）。膿血便標本經培養後，平皿上菌落數較前一種標本要少很多，多數隻有1,2 區有菌,而3 ,4 區無菌或菌落極少，可見到1-3 種菌落，多為G-杆菌；有可疑菌落，需進行分離鑒定。稀糊樣便經培養後，菌落數有部分豐富，部分稀少，前者可以打4 +，後者則打1～2 + ；這種性狀的標本多數可培養出1種以上的細菌，有部分以G-杆菌為優勢菌，有部分以G+球菌為優勢菌，有部分可同時見到G+球菌和杆菌（服整腸生後，糞便中可見到G+杆菌）及真菌3 種或3 種以上菌落，還有部分則以真菌為優勢菌。水樣稀便經培養後，多數菌落稀少，可單獨以G-杆菌或G+球菌或真菌或G+杆菌為優勢菌，也可幾種菌同時出現，另有一些標本，在上述幾種培養基上經72h 培養後仍無細菌生長。

2.3  分離培養  在進行上述2 項試驗的同時，做分離培養。成形軟便經培養，在選擇和非選擇培養基上，一般找不到致瀉菌落。膿血便培養，在選擇培養基上可見到2 種或2 種以上菌落，多數可找到致瀉菌。稀糊和水樣稀便經培養，如G-杆菌為優勢菌，則BA和選擇培養基上都可有多量或少量菌生長，同時可找到致瀉菌菌落；如以G+菌為優勢菌，則BA上可見到多量或少量G+菌菌落，真菌菌落；選擇培養基上無細菌生長（真菌和腸球菌可在選擇培養基上生長）。將分離出的疑似致瀉菌進行係列生化鑒定及血清學鑒定, 568份標本分離出致瀉菌15種302株，見表2 。

2.4 菌譜分析  （l）成形軟便菌群象：細菌量豐富，分布均勻，兩種染色性狀細菌及各種類型的細菌比例基本恰當，未分離出可疑菌落（致瀉菌）的標本可向臨床發出“未檢出致病菌”( BA，SS，Mac）的報告。(2）糞便為粘液膿血便，其菌群象為單一的G-杆菌，細菌量少甚至極少，培養基上能見到可疑病原菌菌落，經生化係列鑒定、血清學鑒定，並做藥敏試驗，向臨床發出鑒定及藥敏報告。（3）糞便為稀糊樣或水樣，其菌群象則為G+球菌、杆菌及G-杆菌、真菌孢子、菌絲，菌量或多或少，呈純菌或無菌；培養有多量或少量G+球菌菌落、酵母樣真菌菌落，或為某種菌的純培養，或各培養基上無菌生長（24h , 48h , 72 h 培養），對上述菌落可做鑒定，並根據菌群象、菌群培養、分離培養粗略估計某種菌的百分比，向臨床發出“XXX 菌％”、“無細菌生長”( BA，SS，MaC，營養平皿），提示“菌群失調”報告，不報告分離菌的藥敏結果。各科室菌譜分析統計結果見表3 。

2.5 糞便塗片與分離培養結果  對照302份陽性標本糞便塗片與分離培養結果相符，67 份不相符。見表4 。

3 討論

 

    在人類腸道中存在著大量的微生物（如細菌、原蟲、病毒等），其中主要是細菌，約占糞便固體總量的20％-30 % ，正常人糞便中的菌群分為常居菌和過路菌兩大類，在這些菌中99％以上是厭氧菌（多數為G+杆菌），需氧菌不到1％。乳嬰糞便中多為G+菌（為嗜酸性乳杆菌、雙歧杆菌類及糞鏈球菌）, 而成人糞便中除占優勢的厭氧菌外多為埃希菌類，所有這些細菌組成人類腸道正常菌群。腸道正常菌群在一般情況下，數量及各菌種間的比例都處於一種相對的動態平衡中。對機體的營養、消化、吸收、防禦疾病，保持人體與外界環境的平衡起著重要的作用。一旦由於某種原因破壞了正常菌群內各種微生物之間的相互製約的關係，使菌群的量和種類的比例發生變化時，腸道微生態環境被破壞，即出現暫時或持久的菌群失調，腸道功能發生紊亂，甚至出現明顯的臨床症狀---腹瀉。

    對於腹瀉，臨床上習慣用病理學的觀點尋找病因，而忽視用生理學的觀點與方法去研究。本文試圖用病理學與生理學相結合的方法對腹瀉患者進行病原微生物的檢測及腸道菌群的監測，對糞便進行菌譜分析。一方麵找出病原菌，對腹瀉進行病原學診斷並做藥敏試驗；另一方麵，通過對腸道菌群象的觀察和菌群培養，確定菌群失調，找出致瀉病因，為臨床正確應用抗生素治療，或者停用抗生素進行菌群調整提供科學的依據。

    通過對568份糞便標本進行菌譜分析，檢出（超量）酵母樣真菌98 株，占分離菌總數的32.45 % ，列第1位；菌譜分析為“某種腸球菌50 ％以上”或“無細菌生長”，提示“菌群失調”標本88 份，列第2 位。檢出導致腹瀉的條件致病菌、過路菌（在塗片觀察及菌群和分離培養基上均為明顯的優勢菌，細菌比率在30％以上）88 株（如克雷伯菌屬、銅綠假單胞菌、變形杆菌屬等）；檢出EPEC和誌賀菌屬、沙門菌屬等特異性病原菌75 株。上述實驗資料可以說明現代細菌性腹瀉病的主要病因在很大程度上是由菌群失調所致。因此，糞便細菌菌譜分析將成為對腹瀉病進行病原學診斷和對腸道菌群進行監測的重要手段。在表l中，有31份糞便徐片鏡檢未見細菌或真菌，菌群及分離培養72h 無細菌生長。從表3可以看出，菌譜分析結果以G+球菌或酵母樣真菌為優勢菌，或“無細菌生長”，提示菌群失調，患者往往是住院患者、老年患者、嬰幼兒。這類患者免疫力低下，多數長期患病，或因外科手術，大量使用廣譜抗菌藥物、免疫抑製劑、激素、抗腫瘤藥等，使腸道正常菌群受到嚴重抑製，以致出現糞便標本塗片鏡檢細菌稀少、無菌或培養時無菌生長等現象；或者引發腸球菌、真菌或其他一些耐藥菌株過度繁殖，導致腸道菌群嚴重失調而出現明顯的臨床症狀---腹瀉。表4 顯示，糞便菌群象觀察的陽性率比培養陽性率高11.80 % ，這是因為直接塗片呈現的是腸道原始的微生態環境，許多微生物我們無法辯認或很難培養。

    以上實驗結果說明，腸道菌譜分析不但能為臨床腹瀉病提供病原學診斷依據及藥敏報告，更能對腸道菌群進行監測，也可作為抗菌藥物使用的監測窗口。本方法包括塗片、培養、藥敏試驗3 項主要內容。結果采取分級報告製：2h 報告塗片結果；24h 報告培養結果；最後（48 或72h ）對各項結果進行綜合分析，報告鑒定和藥敏結果。平均出結果時間為36.5h ，比傳統培養及藥敏出結果的60h 大為縮短，並擴大對腹瀉的細菌學實驗診斷範圍。但由於腹瀉病因的多樣性、複雜性，腸道菌譜分析的研究有待進一步深人與完善。

作者：盛茂地  黃金娥  卿秀平 黃宏蘭  張儉《中國感染控製雜誌》