細菌鞭毛染色的方法

目前，細菌鞭毛染色方法根據染色劑的不同，可分為堿性複紅法、副品紅法、結晶紫法、維多利亞藍B法、鍍銀染色法和熒光蛋白染色法6類，前5類方法的媒染劑成分中均含有單寧酸，染色原理通常是采用不穩定的膠體溶液做媒染劑，並使其沉澱於鞭毛上而使“鞭毛腫脹（tar and feather）”，鞭毛直徑加粗，進一步染色後即可在油鏡下觀察。
1. 堿性複紅法和副品紅法：1926年由Gray首創，其媒染液成分包括20%丹寧酸水溶液2.0ml，硫酸鉀鋁飽和水溶液5ml，飽和氯化汞水溶液2ml，3%堿性複紅乙醇（95%）溶液0.4ml，臨用前混合，且需過濾後方可使用。染片時，媒染劑染色約6min，具體時間尚需在試驗中摸索確定，染色液是抗酸染色Ziehl-Neelsen石碳酸複紅染液，染片時需要1小片吸水紙蓋在塗片上，染色3min。由於該方法媒染劑混合物不穩定、操作複雜、經驗性強。Leifson於1930年建立了副品紅法，並於1938年和1951年兩次對該方法進行了改良，稱為Leifson方法。染色試劑由3種溶液組成：A為1.5%NaCl水溶液，B為3%單寧酸水溶液，C為乙酸副品紅0.9g，堿性副品紅0.3g溶解於100ml95%乙醇溶液中。使用時把等體積A和B混合，然後再加2體積C與之相混。該試劑冷藏可保存1～2個月。

2. 結晶紫法：又稱Ryu法，1937年由Ryu建立，1982年由Kodaka等進行了改良。媒染劑：5%石碳酸10 ml，2g單寧酸和10 ml飽和硫酸鉀鋁。染色劑：飽和結晶紫乙醇溶液，即12g結晶紫溶於100 ml無水乙醇中。使用時把10份媒染劑與1份染色劑混合，染色5min。1989年，Heimbrook等使用改良的Ryu染色試劑，采用濕片技術進行鞭毛染色，雖然可以觀察到細菌鞭毛，但效果不好。Ryu染色方法優點是試劑比較穩定，目前Difco公司已經研製出該方法的商品試劑盒，但染色效果亦不甚理想.
3. 維多利亞藍B法：1990年由Inoue等報道日本製藥株式會社Shionogi Seiyaku研製出一種細菌鞭毛染色商品試劑盒。其試劑組成包括維多利亞藍B、苯酚、單寧酸和硫酸鉀鋁，染色約需7min。該試劑保存期約為6個月，關於其染色效果雖然有過一篇文獻評述，但卻沒有采用評分法進行評價，很難判斷其染色效果。
4. 鍍銀染色法：1958年Rhodes根據Fontana的螺旋體改良鍍銀染色法，建立了一種細菌鞭毛鍍銀染色法。試劑分為媒染劑和銀染劑。媒染液：10%單寧酸10 ml加5 ml飽和硫酸鉀鋁水溶液，再加1 ml苯胺飽和水溶液形成沉澱，通過搖動又能重新溶解，加入5%FeCl3水溶液1 ml形成黑色溶液，穩定10 min後使用。銀染液：配製5%AgNo3水溶液100 ml取出10 ml備用，再緩慢加入濃氨水（比重0.880）使形成的沉澱剛好重新溶解，最後把備用的10 mlAgNo3溶液向其中逐滴加入，直到搖動後呈現輕微而穩定的薄霧狀溶液為止，避光保存，可穩定數周。用媒染液染片3～5min，蒸餾水充分洗滌後，再把銀染液滴加至塗片上。加熱至接近沸騰，染色3～5min。由於Rhodes鍍銀染色法媒染液成分複雜、操作繁鎖，所以1965年Blenden等改良了細菌鞭毛鍍銀染色法的配方。試劑A：100 ml蒸餾水中加入5 g單寧酸，1.5 gFeCl3，15%福爾馬林2 ml，1%NaOH溶液1 ml。試劑B：使用2% AgNo3，其他同於Rhodes，但試劑不穩定，要求在4h內使用，並用要用氨水調pH至10。試劑A染片2～4min，試劑B染色30 s，不需加熱。由於以上兩種鍍銀染色方法都要使用營養瓊脂斜麵培養物，並且需用無菌蒸餾水懸浮菌液製片，未采用評分法評價鍍銀染色方法。因此1977年，West等對鍍銀染色法進一步改良，製備塗片時直接使用血平板，評價染色效果首次使用5分製，通過該評價方法證明了加熱銀染液染片可以提高染色效果。試劑配方：媒染液為飽和硫酸鉀鋁水溶液25 ml，10%單寧酸50 ml，5%FeCl3水溶液5 ml，5℃保存，染色液配製同Rhodes，但需避光5℃保存。媒染液染片4min，銀染液滴加至塗片上加熱至微冒蒸汽，染色4min。同時West等還對使用不同培養基進行染色效果評價，包括半固體動力培養基、血瓊脂平板、TSA（trypticase soy agar）斜麵，其中半固體動力培養基和TSA斜麵25℃，培養18～24h；血瓊脂平板35～37℃，培養18～24h。評價結果血瓊脂平板35～37℃，培養18～24h不適於細菌鞭毛染色，而半固體動力培養基和TSA斜麵25℃，培養18～24h適合於細菌鞭毛染色，同時也證明了使用福爾馬林處理標本製備塗片並不能有效阻止鞭毛脫落。由於鍍銀染色法媒染液不穩定，需避光5℃保存，1992年Porter等繼續改良該方法，其試劑配方同West等的方法，隻是媒染劑避光室溫可保存數月，延長媒染劑染色時間為8 min，染色液不需加熱，隻染30 s，製備塗片程序略有不同。使用TSA平板，36℃培養24h，但遺憾的是Porter等隻使用了1種細菌（奇異變形杆菌）進行研究。於是1994年Finegan等進一步證實使用過期媒染劑進行鍍銀染色可以增強鞭毛染色效果，並使用4種細菌（綠膿假單胞、奇異變形杆菌、黏質沙雷菌、枯草芽孢杆菌），用trypitcase soy肉湯及其瓊脂平板，26℃培養24h。試劑配方仍不變，媒染液放置1、2、4、8、16周後進行染色，媒染液染色8 min，銀染液染色30～60 s，不需加熱。這4種細菌均染色成功，從而證明媒染液可至少放置16周。
5、鞭毛的負染：具體操作：菌懸液，直接滴在銅網上，1－2分鍾後，吸去多餘的菌液（似幹非幹的程度），再滴上0.1％的磷鎢酸溶液，1分鍾後，吸去多餘的染液，然後就可以在電鏡下觀察了。一般染色後十五天之內看電鏡。時間太長效果不好。這是我試驗用的方法。
6、我喜歡用銀染法，曾做過一段時間的細菌鑒定，以下是我一些染色心得：首先染色用玻片一定要幹淨，洗液泡過之後蒸餾水衝洗幹淨。塗片的時候菌千萬別塗得太多。第一部染色時，可將玻片置於水浴鍋內，溫度保持在35度,蓋上蓋（主要是保持一定的濕度，防止染色液變幹不利於衝洗，這步非常有用)。一定要將第一步使用的媒染液衝洗幹淨，否則影響染色效果，背景可能非常 髒。其他的步驟參考書上的資料進行，一般沒什麽問題。我用這種方法染單鞭毛的弧菌，效果非常好。

注意事項：
1. 要注意培養條件和培養時間：①用點接法在新配製的牛肉膏蛋白腖半固體平板上接種。一般一個平板點接3～4處。經比較用半固體培養基培養出來的菌體活動度大，鞭毛長且多，易於染色，這可能與半固體培養基更適於菌體運動、鞭毛生長較好有關。用點接種法在平板上接種更易於挑取邊緣幼齡的菌體。②培養時間要嚴格掌握，一般培養9～12h較好，菌齡超過15h，鞭毛染色效果較差，這可能與老齡菌體活動度降低、鞭毛易脫落有關。

2.染色過程中的細節也應充分注意：①取菌要取菌落邊緣的幼齡菌體。②取菌後的接種環在載片上的蒸餾水中輕輕沾幾下即可，不要用力太猛，更不能用接種環大幅度塗開；將載片稍傾斜，使菌液散開即可，否則鞭毛易脫落，造成染色失敗。③鞭毛染色的玻片隻能自然幹燥，不能用熱風吹幹，不能熱固定，這是由於加熱後菌體易變形，鞭毛易脫落，影響觀察。④A染液染3～5 min，其後用蒸餾水（自來水效果差）衝洗時一定要充分，否則加B染液後，背景很髒，鞭毛不易被觀察到，影響實驗效果。⑤加B染液後，將玻片稍加熱（但不能太熱，更不能沸騰或蒸幹）使其微冒蒸汽，30～60 s，染色效果較不加熱為好。⑥B染液染完後，用蒸餾水衝洗比用自來水衝洗效果好。