煙曲黴不同菌株致病力差異的研究

【摘要】  目的 通過篩選出致病力最強和最弱的菌株研究煙曲黴的致病機製。方法 SPF級雄性ICR小鼠216隻，體重(20±0.5)g。隨機分9組，每組8隻（感染組7組，陰性對照組和正常對照組各1組）。其中感染組和陰性對照組小鼠免疫抑製後，分別接種7株煙曲黴的孢子懸液和生理鹽水。正常對照組不注射環磷酰胺和孢子懸液。每日觀察小鼠的生存狀態。對死亡小鼠和處死小鼠的髒器進行組織勻漿菌落計數和病理學檢測。實驗重複3次。通過比較生存率、中位生存期、平均體重、組織勻漿菌落計數和組織病理學變化等來比較煙曲黴的致病力差異。結果 ①感染組小鼠接種孢子懸液後，體重迅速下降。肺組織病理學檢測觀察到組織壞死，菌絲聚集；肺組織勻漿培養得到的菌株經分子生物學鑒定為煙曲黴。②陰性對照組小鼠體重下降速度較感染組慢，無死亡；肺組織病理學檢測未見菌絲侵襲。③通過比較生存率、中位生存期、組織病理學變化等指標，從7株煙曲黴中篩選得到致病力最強和最弱的菌株（煙曲黴JLC 50134和JLC 30566）。結論 不同煙曲黴菌株間存在致病力的差異。

【關鍵詞】  致病力；動物模型；煙曲黴

　　煙曲黴（Aspergillus fumigatus）感染所致侵襲性肺曲黴病（IPA）是引起高危患者（如中性粒細胞減少症、造血幹細胞移植、長期高劑量使用激素和血液惡性腫瘤等免疫力低下患者）致死性感染的主要原因。由於IPA的發病率高、病情進展迅速、死亡率高（60%～90%）及缺乏有效的治療藥物〔1～2〕，其相關研究受到了極大關注。目前，煙曲黴的致病機製尚不明確，已往的研究多集中在通過改造單一或幾個與致病性相關的基因來研究菌株的致病機製〔3〕，而通過比較不同煙曲黴菌株間致病力差異進行研究在國內尚未見報道。獲得致病力不同的菌株，可以全麵、係統地分析和比較與致病力相關的諸多因素，對煙曲黴的致病機製以及治療藥物開發等方麵的研究非常必要。本研究將通過評價生存率、中位生存期、組織病理學變化等指標，比較7株不同煙曲黴致病力的差異。
　
　　1  材料與方法

　　1.1  材料 

　　SPF級ICR小鼠216隻，雄性，6周齡，體重(20±0.5)g，由吉林大學白求恩醫學院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK吉20072003。實驗過程中對動物處置符合2006年科學技術部發布的《關於善待實驗動物的指導性意見》〔4〕。煙曲黴共7株，其中，強毒株JLC 50134由日本國立千葉大學真菌醫學研究中心饋贈，編號IFM 40808。JLC 30542、JLC 30890、JLC 30859、JLC 30566、JLC 31106及JLC 31753分離自臨床患者和環境樣本，經分子生物學鑒定後，由吉林大學真菌研究中心菌種保藏中心(Culture Collection of Jilin University Mycology Research Center)分離並保藏。
   
　　實驗用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA）購自Difco公司，注射用環磷酰胺購自江蘇恒瑞醫藥股份有限公司。

　　1.2  方法

　　1.2.1  孢子懸液的製備 

　　將煙曲黴接種於PDA斜麵培養基上，28℃培養5 d。用含有0.05%吐溫 80的生理鹽水製備一定濃度的孢子懸液。將孢子懸液進行連續稀釋後塗布在PDA平板培養基上，28℃培養3 d，進行菌落計數，與塗布的孢子懸液濃度進行比較，計算孢子活力〔（菌落計數×稀釋倍數）/孢子懸液濃度〕＞90%可進行接種〔5〕。

　　1.2.2  接種濃度的確定 

　　配製煙曲黴JLC 50134的孢子懸液（濃度：1.0×103～1.0×109 CFU/ml共7個梯度）感染小鼠，每個濃度10隻，預計選用3 d內導致50%小鼠死亡的孢子懸液濃度作為實驗接種濃度〔5〕。

　　1.2.3  動物的免疫抑製和分組 

　　隨機挑選小鼠216隻，分9組（感染組7組，陰性對照組和正常對照組各1組），每組8隻。飼養於IVC鼠籠中，室溫（24℃～26℃），保持濕度，日照14 h和黑夜10 h交替進行，墊料、食物和水滅菌處理。飲水中加入四環素（1 mg/ml）防止細菌感染，實驗過程中不限食水。感染組和陰性對照組第1、4天腹腔注射環磷酰胺（150 mg/kg）進行免疫抑製〔5〕，第5天尾靜脈采血計數外周血白細胞數量，通過白細胞減少的程度確定小鼠是否受到免疫抑製。

　　1.2.4  實驗動物的接種 

　　小鼠通過吸入乙醚麻醉，使其昏迷超過1 min，抑製吞咽反射。取30 μl不同濃度或不同菌株的煙曲黴孢子懸液（孢子活力＞90%）滴入一側鼻孔；陰性對照組小鼠進行同樣麻醉，接種等量的含有0.05%吐溫80的生理鹽水；正常對照組小鼠不注射孢子懸液和生理鹽水。

　　1.2.5  動物感染過程監測、髒器處理及感染菌株鑒定 

　　感染後15 d內，每日觀察小鼠的生存狀態，測量體重，計算生存率；取感染死亡小鼠的肝髒、脾髒、腎髒和肺髒進行組織勻漿，稀釋至濃度為1.0×10-3g/ml。取200 μl塗布在PDA平板培養基上，28℃培養3 d，進行菌落計數。將髒器剩餘部分用10%（v/v）甲醛固定，浸入石蠟，切片，HE染色。15 d後，將仍然存活的小鼠頸椎脫臼法處死，處死小鼠的肝髒、脾髒、腎髒和肺髒的操作同前。將組織勻漿培養得到的菌株，利用小瓊脂塊培養法進行初步鑒定。提取菌株DNA，利用真菌通用引物(E1m4和rE2m4)擴增線粒體細胞色素b基因片段〔6〕，並進行DNA序列測定。將測定結果與GenBank中煙曲黴序列進行比對，以驗證該菌株是否為煙曲黴。以上實驗重複3次。

　　1.2.6  煙曲黴致病力的比較 

　　通過綜合分析生存率、中位生存期、平均體重、肺組織勻漿的菌落計數及其組織病理學變化來比較7株煙曲黴的致病力。

　　1.3  統計學處理   應用SPSS16.0軟件對生存率進行Logrank檢驗，對Log (CFU/gram)進行方差分析。

　　2  結果

　　2.1  接種濃度的確定 

　　接種煙曲黴JLC 50134 共7個濃度的孢子懸液，生存率計算結果見表1。發現濃度為1.0×107 CFU/ml時，在第3天50%的小鼠死亡，確定該濃度為實驗接種濃度。表1  煙曲黴不同濃度孢子感染小鼠生存率(略)

2.2  小鼠的生存狀態 

　　注射環磷酰胺前，小鼠外周血白細胞計數為（7.2±0.23 ）×109 CFU/ml，注射環磷酰胺後第5天，小鼠外周血白細胞計數為（1.5±0.45 ）×109 CFU/ml，證實小鼠處於免疫抑製狀態〔7〕。感染組小鼠接種孢子懸液2～3 d後，可見活動減少；7～8 d後表現為消瘦、體重急速下降，甚至死亡。陰性對照組小鼠接種等量生理鹽水1～2 d內，活動減少，體重稍有下降，2 d後逐漸恢複正常，無死亡。正常對照組小鼠活動良好，體重上升。

　　2.3  小鼠生存率比較 

　　JLC 50134感染小鼠的生存率較低，接種後第2天開始出現小鼠死亡，第3天時迅速下降至50%，第4天時生存率僅為10%，第5天時生存率為0。而JLC 30566感染小鼠在第5天時才出現死亡，第6天時生存率達50%，此後再無下降。JLC 31106感染小鼠第5天生存率為75%，至第7天時下降至37.5%，第10天後生存率降至25%。另4株煙曲黴感染小鼠的生存率變化與JLC 31106感染小鼠相似。JLC 50134感染小鼠的中位生存期為4，JLC 30566感染小鼠的中位生存期為6，其他5組均為5。Logrank檢驗結果為χ2=14.288，P<0.05。故可認為7組小鼠總體生存率的差別有統計學意義，說明JLC 50134感染小鼠生存率較低，JLC 30566感染小鼠生存率較高。見圖1。

　　2.4  小鼠平均體重比較 

　　7組小鼠感染後平均體重均開始下降，JLC 50134感染小鼠平均體重下降的幅度和速度最大，第3～4天1 d內小鼠平均體重下降約8.0 g，此後全部小鼠死亡。說明該菌感染造成的病理損害非常嚴重和迅速。JLC 30566感染小鼠的平均體重下降的幅度和速度最小，在第5～6天時下降約3.6 g，第7天後逐漸停止下降，隨後稍有上升。說明該菌感染造成的病理損害相對較輕。其他5組的變化介於上述兩者之間，下降幅度最大者1 d內約為4.9 g。陰性對照組僅在接種生理鹽水後的5 d內平均體重下降，隨後逐漸上升，在第9天後逐漸恢複至接種前水平，並不斷上升。見圖2。

　　2.5  小鼠的組織勻漿培養和菌落計數 

　　將小鼠肝髒、脾髒、腎髒和肺髒的組織勻漿塗布在培養基上，28℃培養2～3 d。除肺髒出現白色絨毛樣絲狀真菌菌落外，其他髒器均未見有菌生長。3 d後菌落呈深綠色粉末狀，背麵淡黃褐色。經小瓊脂塊培養、乳酸酚棉蘭染色，顯微鏡下可見多呈45°角分支的分生孢子梗，燒瓶狀的頂囊，單層小梗位於頂囊上半部，小梗上可見鏈狀排列的球形分生孢子。結合菌落特征和顯微鏡下形態學特點，初步鑒定為煙曲黴。計數7株菌感染小鼠肺組織勻漿的菌落數量，以Log (CFU/gram)表示，結果見表2。培養至第3天，陰性對照組和正常對照組組織勻漿無菌生長。7個感染組的組織勻漿菌落計數Log值在2.995 4±0.034 1之間，組間差異無統計學意義(P>0.05)，說明7組間小鼠肺組織勻漿培養得到的菌量一致。表2  7株煙曲黴感染小鼠肺組織勻漿菌落計數（略）

　　2.6  菌株的分子生物學鑒定 

　　利用真菌通用引物擴增得到約420 bp的線粒體細胞色素b基因片段，見圖3。經過DNA序列測定以及序列比對，證實肺組織中分離得到的菌株是煙曲黴。

　　2.7  小鼠的肺髒組織病理學觀察 

　　感染組小鼠肺髒組織切片可見致密、有隔、寬度均一（3 ～ 6 μm）的菌絲，放射狀或片狀生長。分生孢子梗多呈45°角分支，有時可見菌絲侵入血管，伴有肺組織的充血、出血和炎症細胞浸潤。
   
　　煙曲黴JLC 50134和JLC 30566感染小鼠的組織病理學變化見圖4。結果顯示，JLC 50134感染小鼠肺組織有出血和充血，大量孢子萌發成菌絲體（箭頭所示），聚集在血管周圍並侵入組織，造成肺泡壁的破壞、炎症細胞浸潤（圖4a）。JLC 30566感染小鼠可見肺組織結構較為完整，僅有少量出血和炎症細胞浸潤（圖4b）。通過比較7株煙曲黴感染小鼠的生存率、平均體重、組織病理學變化等指標，篩選出了致病力最強的菌株JLC 50134和最弱的菌株JLC 30566。

3  討論
   
　　煙曲黴是一種腐生菌，在環境中分布廣泛，且其分生孢子體積微小，極易被人體吸入。若吸入肺泡中的煙曲黴分生孢子逃過宿主的免疫防禦係統，就會萌發產生菌絲，侵入肺組織並血行播散至全身引起感染。由於煙曲黴常侵犯免疫力低下的患者，因此選用環磷酰胺腹腔注射造成免疫抑製狀態，以提高小鼠對煙曲黴的敏感性。鑒於煙曲黴造成的IPA多為分生孢子經鼻腔吸入肺內所致〔8〕，因此本研究選擇鼻腔接種法進行感染，相比氣管內接種更加簡便快速，對小鼠的傷害較少，能更真實的模擬感染過程，並可避免感染過程中小鼠的意外死亡；此外，該方法容易定量，便於比較不同菌株間致病力的差異。
   
　　本研究發現，煙曲黴JLC 50134感染小鼠後，生存率下降最快，造成的病理損害最為嚴重，而煙曲黴JLC 30566感染小鼠後，生存率下降較慢，病理損害較輕。說明JLC 50134和JLC 30566在致病力上存在顯著差異，認為分別是致病力最強和最弱的菌株。目前認為煙曲黴致病機製與很多因素相關，研究表明雖然宿主呼吸道內的纖毛可以有效地清除一些分生孢子，但是真菌分生孢子侵入宿主肺泡內，黏附於肺泡基底膜是感染的第一步〔9〕。同時機體的肺泡巨噬細胞在清除分生孢子並阻斷孢子萌發方麵也有一定的作用。Paris等〔10〕發現煙曲黴黏附因子缺失突變株仍能在肺內定植。而本研究在比較煙曲黴致病力差異時，發現組織勻漿的菌落計數無顯著性差異，說明這幾株菌的分生孢子能夠黏附並定植於肺組織。這與Paris的研究結果相一致。因此，推斷菌株致病性可能與孢子的萌發、分泌水解酶和毒性代謝產物等作用相關。今後致病機製的相關研究將從這些方麵深入細致地開展。

作者：張宇 宋文剛 高嵩 劉攀 王麗 《中國老年學雜誌》

【參考文獻】
  　1 Dagenais TR，Keller NP.Pathogenesis of Aspergillus fumigatus in Invasive Aspergillosis〔J〕.Clin Microbiol Rev，2009;22(3):44765.
　　2 Vonberg RP，Gastmeier P.Nosocomial aspergillosis in outbreak settings〔J〕.J Hosp Infect，2006;63(3):24654.
　　3 Ma Y，Qiao JJ，Liu W，et al.The shol sensor regulates growth,morphology，and oxidant adaptation in Aspergillus fumigatus but is not essential for development of invasive pulmonary aspergillosis〔J〕.Infect Immun，2008;76(4):1695701.
　　4 中華人民共和國科學技術部.關於善待實驗動物的指導性意見〔〕.2006；09：30.
　　5 Dixon DM，Polak A，Walsh TJ.Fungus dosedependent primary pulmonary aspergillosis in immunosuppressed mice〔J〕.Infect Immun，1989;57(5):14526.
　　6 Wang L，Yokoyama K，Miyaji M，et al.Mitochondrial cytochrome b gene analysis of Aspergillus fumigatus and related species〔J〕.J Clin Microbiol，2000;38(4):13528.
　　7 熊延靖，王萍,董 群.免疫抑製小鼠係統性白色念珠菌感染模型建立的研究〔J〕.皖南醫學院學報,2008;27(6)：4035.
　　8 Quezada G，Koshkina NV，ZweidlerMcKay P，et al.Intranasal granulocytemacrophage colonystimulating factor reduces the aspergillus burden in an immunosuppressed murine model of pulmonary aspergillosis〔J〕. Antimicrob Agents Chemother，2008;52(2):7168.
　　9 Jahn B，Langfelder K，Schneider U，et al.PKSPdependent reduction of phagolysosome fusion and intracellular kill of Aspergillus fumigatus conidia by human monocytederived macrophages〔J〕.Cell Microbiol，2002;4(12):793803.
　　10 Paris S，Debeaupuis JP，Crameri R，et al.Conidial hydrophobins of Aspergillus fumigates〔J〕.Appl Environ Microbiol，2003;69(3):15818.

上一篇：環丙沙星聯合治療複治菌陽肺結核近期療效觀察

下一篇：川芎提取物的抑菌殺蟲作用研究