酵母菌發酵川烏、附子的初步研究

【摘要】  目的探討酵母菌發酵對川烏、附子(黑順片)中總生物堿含量的影響。方法采取酵母菌直接發酵和以麵粉為基質進行酵母菌擴增，之後再與川烏、附子混合兩種發酵方法，水煎提取、測定總生物堿含量和浸膏得率。結果酵母菌直接發酵生物堿含量最高，酵母菌+麵粉再與川烏、附子混合發酵後生物堿含量略低，但浸膏得率最高，兩種方法發酵均高於傳統水提法。結論酵母直接發酵川烏、附子能明顯提高總生物堿含量和浸膏得率。

【關鍵詞】  川烏; 附子(黑順片); 酵母發酵; 總生物堿; 浸膏得率

川烏為毛茛科烏頭屬植物烏頭的幹燥主根, 具有祛風除濕，散寒止痛的功效，附子為子根，具有回陽救逆，助陽補火，散寒止痛的作用。川烏、附子兩藥材同源，均為臨床常用品。川烏、附子的主要成分之一生物堿是祛風除濕、散寒止痛的有效成分，同時又是導致中毒的成分，由於烏頭堿致毒事件頻頻發生，製約了烏頭屬中藥的應用[1],《中國藥典》2005 版規定川烏、草烏的用量減至35 g，以減量減毒，這種做法以療效為代價換取用藥安全。如何通過簡單設備、方便操作、低成本加工保證川烏、附子的療效，同時又降低其毒副作用，達到減毒增效是現代中藥研究的主要課題之一[2]。發酵是傳統中藥加工的重要方法之一，發酵作為一種加工工藝不但改變煎、煮、熬、煉、蒸、浸的傳統工藝，而且使藥效提高、藥性發生改變，在有毒藥物的研究方麵蘊藏著極大潛力[3]。為此本研究嚐試以無毒副作用的酵母菌發酵川烏、附子，闡明此菌發酵對附子、川烏中總生物堿含量的影響，為下一步藥效和毒理學研究提供理論依據。

　　1 材料與儀器

　　1.1 材料製川烏、附子(黑順片)均購自河北安國長安藥材行，經聯合大學生物化學工程學院製藥工程教研組鑒定為正品;安琪高活性幹酵母，安琪酵母股份有限公司產品;蛋白腖、酵母浸粉、瓊脂粉，北京奧博星生物技術有限責任公司產品;葡萄糖，北京化學試劑公司產品;溴甲酚綠(BCG)試液依照2005年版《中國藥典》配製;烏頭堿對照品，中國藥品生物製品檢定所產品，批號：11072-200410。

　　1.2 儀器超級潔淨工作箱DL-CJ-2ND(北京東聯哈爾儀器製造有限公司);立式壓力整齊滅菌器LS-835L型(江陰濱江醫療設備廠);新型恒溫振蕩器ZHWY-2102(搖床);電熱恒溫鼓風幹燥箱DHG-9070A型(上海一恒科學儀器有限公司);烘箱(天津市中環實驗電爐有限公司);SHB-95型循環水式多用真空泵(河南省予華儀器有限公司);RE-52C旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠);DZTW調溫電熱套(北京市永光明醫療儀器廠);HW·SY11-K數顯恒溫水浴鍋(北京市長風儀器儀表公司);TU-1901雙光速紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。

　　2 方法與結果

　　2.1 麵粉發酵粉碎川烏、黑順片至1020目，以少量水浸泡川烏、黑順片粉末。取幹酵母0.5 g，溫水衝開，與10 g麵粉混勻，平鋪於培養皿，置29℃恒溫培養箱發酵23 h，取出，分別與40 g川烏、40 g黑順片、20 g川烏+20 g黑順片粉末混合均勻，平鋪於培養皿，根據預試驗結果培養5 d，藥材表麵出現白色和黃色菌落。

　　2.2 酵母菌發酵YPD液體培養基：蛋白腖20 g，酵母浸粉10 g，葡萄糖20 g於1 000 ml水中。

　　YPD固體培養基：蛋白腖20 g，酵母浸粉10 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g於1 000 ml水中。

　　酵母菌活化培養：固體培養基高壓滅菌後，倒入平板，23 h凝固，待用。用少量無菌水溶解幹酵母成膏狀，挑取膏狀酵母，接種後放入29℃培養箱培養3 d待用。

　　酵母菌擴大培養：挑取已活化的菌體，深入液體培養基中輕輕攪拌，於29℃搖床培養3 d，待用。

　　川烏、黑順片發酵：無菌條件下，將活化培養的200 ml酵母菌懸液分別與高壓滅菌的川烏40 g，黑順片40 g，川烏20 g+黑順片20 g，粉末攪拌，根據預試驗放入29℃搖床培養5 d，菌懸液顏色變深。

　　2.3 提取分別取發酵前後的川烏、黑順片各40 g，川烏20 g+黑順片20 g，用300 ml蒸餾水煮3次，時間分別為1.5，1，0. 5 h，過濾，合並濾液,離心，取上清，減壓蒸發至100 ml。分別取上述濃縮液50 ml，用氨試液調pH=9，之後依次用乙醚25 ，20，15，10 ml萃取4次，上層溶液水浴蒸幹，取氯仿共5ml轉移殘渣至分液漏鬥，以HCl(0.1 mol/L)5，5，5 ml萃取3次，合並上層液，氨試液調pH=9，再用三氯甲烷10，10，10 ml萃取3次，取下層，水浴蒸幹。用0.01 mol/L HCl將殘渣轉移定容至10 ml容量瓶中，進行總生物堿檢測。

　　2.4 總生物堿檢測

　　2.4.1 烏頭堿對照品溶液配製精密稱取烏頭堿標準品2.53 mg置10ml容量瓶，以0.01 mol/L的鹽酸溶液定容，作為對照品。

　　2.4.2 檢測波長確定取一定量的對照品溶液於100 ml分液漏鬥中，加入pH=3.50的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩衝液5.0 ml，BCG試液2.0 ml，氯仿10.0 ml，加適量蒸餾水使水相成10 ml，充分振搖均勻，靜置1 h分層。將下層氯仿液放入裝有少量無水硫酸鈉的10 ml容量瓶中。另取10.0 ml氯仿置100 ml分液漏鬥中,同法操作，作為空白對照，於200700 nm波長範圍內進行光譜掃描。結果表明本品在412.5 nm處有最大吸收峰，在此波長下空白對照的幹擾比較小。見圖1。

1-樣品;2-標準品;3-陰性樣品

　　圖1 烏頭堿-BCG紫外可見光譜

　　2.4.3 標準曲線的製備精密量取烏頭堿標準溶液，0.4，0.5，0.6 ，0.7，0.8，0.9 ml，分別置於幹燥分液漏鬥(100 ml)中，加緩衝劑5.0 ml，溴甲酚綠溶液2. 0 ml，蒸餾水定容10.0 ml，搖勻。再精密加入氯仿10.0 ml,充分振搖3 min,靜置1 h後，分取氯仿液至已放入0. 5 g無水硫酸鈉的試管中,放置0. 5 h。另取10 ml氯仿，置於幹燥分液漏鬥(100 ml)中,同法操作，作為空白對照。於412.5nm波長處進行吸光度值測定，繪製標準曲線。烏頭堿標準曲線圖如圖所示。計算得標準曲線方程為: Y=0.002 78X+0.023 14，r=0.999 6。結果表明,在10.1222.77 μg/ml範圍內線性良好。根據標準曲線計算總生物堿含量[4]。

　　2.4.4 穩定性實驗準確移取對照品溶液0.8 ml，按“2.4.2”項的方法操作，在412.5 nm處，分別在0.5，1.0， 1.5，2.0，2.5和3.0 h測定不同時間段對照品溶液吸光度，並計算相對標準偏差(RSD=0.79)。見表1。表1 烏頭堿-BCG絡合物穩定性測定結果

　　2.4.5 重現性實驗準確移取標準品溶液0.5 ml共6份，按“2.4.2”項的方法操作，於412.5 nm波長處測定吸光度值，並計算RSD=3.17%。見表2。

　　2.4.6 加樣回收率實驗取已知含量的樣品6份，加入含量一定的烏頭堿對照品溶液，按“2.4.2”項，在412.5 nm處測定其吸光度值,計算其加樣回收率，結果表明，該方法的回收率在97.34%100.31%之間，平均回收率為99.27%，RSD=1.16%，表明該方法結果可靠。見表3。

　　2.5 幹浸膏含量測定分別取發酵前後的川烏、黑順片各40 g，川烏20 g+黑順片20 g，用300 ml蒸餾水煮3次，時間分別為1.5，1，0.5 h，過濾,合並濾液,離心，取上清，減壓蒸發至100 ml。按照2005年版《中國藥典》Ⅰ部附錄X.A浸出物測定法，各精密取提取液10 ml，置已幹燥至恒重的蒸發皿中，水浴蒸幹，於105℃烘3 h，轉移至幹燥器中，冷卻30 min，精密稱重，計算幹浸膏含量，酵母菌+麵粉發酵浸膏得率最高。見表4。表2 重現性測定結果

　　2.6 川烏和附子中總生物堿含量測定精密量取按“2.3”項下製備的9種提取液，按“2.4.2”項方法，在412.5 nm處測定吸光度，並計算含量。與傳統水煎組比較, 酵母菌+麵粉發酵或酵母菌直接發酵均能夠增加各組中總生物堿的含量，在各種組合中，酵母菌直接發酵川烏+附子總生物堿含量最高0.39 mg/g，傳統水煎附子生物堿含量則最低0.20 mg/g;酵母菌直接發酵川烏、附子、川烏+附子總生物堿含量均增加。在浸膏得率方麵酵母菌+麵粉發酵較高(39.5%)。見表4。表4 不同處理對方川烏、附子中總生物堿含量和幹浸膏得率的影響

　　3 討論

　　微生物發酵已成為中藥現代化研究的重要內容之一，利用中草藥發酵已從單味藥涉及到複方且取得顯著成果，成藥片仔癀即是用麝香、牛黃、蛇膽、三七等名貴中藥的微生物發酵物，為臨床退黃、消腫的良藥[5]。酵母無毒，生長繁殖快，培養基和培養條件簡單，發酵能力強，因此本研究以川烏和黑順片為基質進行酵母菌發酵，結果表明酵母菌發酵川烏+附子總生物堿含量(0.39 mg/g)明顯高於其它組合，而兩種發酵方法均高於未發酵的對照組，由此推斷，酵母發酵可使川烏、附子中總生物堿含量增加。微生物可利用中藥材為營養進行分裂、生長、代謝和繁殖，在代謝過程中分泌蛋白酶、纖維素酶、半纖維素酶、果膠酶、澱粉酶等幾十種胞外酶進入培養基，使細胞破裂，細胞間隙增加，減小細胞壁、細胞間質等傳質屏障對有效成分從胞內向提取介質擴散的傳質阻力，使有效成分提取率明顯升高[6]。酵母菌直接發酵上述藥材總生物堿增加顯著，可能是因為酵母菌直接以川烏和黑順片中的成分為營養源，發酵充分、完全，而以麵粉為基質進行酵母菌擴增，之後再與川烏、附子混合發酵後總生物堿含量較酵母菌直接總生物堿含量低，因為酵母菌常生長在含糖(或鹽)量較高的環境中,可優先利用麵粉中的糖類為營養[7]，而對藥材的利用率降低，同時加入麵粉會影響生物堿的溶出，故導致其對川烏和黑順片的利用率相對較低，酵母菌+麵粉發酵組幹浸膏得率最高(39.5%)，是否與加入的麵粉有關有待於進一步研究，由於除沉過程對有效成分有影響，因此本研究認為酵母菌直接發酵程序簡單、操作方麵、總生物堿較高，值得深入研究。

微生物發酵可使中藥材含量和成分發生變化，如酵母菌發酵大黃後，總蒽醌含量略有降低，結合型蒽醌含量降低，但遊離型蒽醌含量增加6倍左右[8]。川烏和黑順片中的生物堿-雙酯型二萜類生物堿，如烏頭堿、次烏頭堿、新烏頭堿，既是有效成分，也是毒性成分，雙酯型生物堿經轉化可分解成毒性較小的單酯類生物堿[9]。本研究酵母發酵川烏和黑順片總生物堿增加顯著，其中雙酯型生物堿與單酯型生物堿的含量變化規律有待於進一步研究，如何通過優化工藝達到減毒增效、提高總生物堿含量繼而開發外用止痛劑，將是本研究下一步要解決的問題。

作者：葛喜珍 劉潔 蘇建樹，鄭來麗，李利輝，趙有璽,田平芳《時珍國醫國藥》

【參考文獻】
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　　[9] Thomas Y.K. Chan. Incidence of Herb-Induced Aconitine Poisoning in Hong Kong[J]. Drug Safety, 2002,25 (11)：823.

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