千裏光水浸液對大腸埃希菌R質粒的消除作用

【摘要】  　　目的探討千裏光對大腸埃希菌R質粒消除作用。方法對尿路感染患者尿液中分離的大腸埃希菌R質粒進行檢測，並選用中藥千裏光水浸液對該質粒進行了體外、體內消除實驗。體外實驗：千裏光水浸液亞抑菌濃度分別作用大腸埃希菌24，48，72 h後，影印培養，計數消除子數；體內實驗：建立腸道去汙染小鼠動物模型後，經口感染大腸埃希菌，同時給千裏光水浸液，灌胃給藥，每隻2 mg/d，分別於給藥後24 ，48，72 h後處死小鼠，分離培養細菌，計數消除子數。消除子經質粒抽提瓊脂糖凝膠電泳鑒定。結果體外藥物作用24，48，72 h後，R質較消除率分別為：0.2%，2.2%，3.8 %；SDS對照組分別為12.1%，14.9%，23.7%，體內藥物作用24，48，72 h R質粒消除率分別為0%，3.1%，14.4%，對照組分別為0%，0.1 %，0.1%。結論中藥千裏光水浸液對大腸埃希菌R質粒於體內、體外均具有消除作用，體內消除作用強於體外。

【關鍵詞】  千裏光 大腸埃希菌 R質粒消除

　　Abstract:ObjectiveTo explore the elimination effect of Senecio scandens Buch-Ham (SSB) Liquid Extracts on R plasmid (RP) of Escherichia coil．MethodsRP of E.coil were isolated from the urine of urinary tract infection patients, and the elimination test of SSB extracts on these plasmids was performed in vitro and in vivo. After sub-bacteriostatic concentration of SSB extracts treated E.coil in vitro for 24 h, 48h and 72h. Replica plating and counting of colonies resisting to antibiotics were carried out. Germ-free mice in intestine were orally inoculated with E.coil, then water decoct agent of SSB was given orally in 2 mg/d per mouse, Eliminant of E.coil was identified by replica plating and colony counting after 24 h, 48h and 72 h, respectively．RP eliminated bodies were identified through electrophoresis with agarose gel. ResultsAfter drug acted on E.coil 24 h, 48h and 72h in vitro respectively, elimination rate of RP in SSB tested group were 0.2%, 2.2%, 3.8%, while in control SDS group were 12.1%, 14.9%, 23.7%，respectively; 24 h, 48h, 72h in vivo, elimination rate of RP in test group were 0, 3.1%, 14.4%, and in control group were 0, 0.1%, 0.1%, respectively.　ConclusionSSB has strong function to eliminate RP of E.coil in vivo and in vitro. The eliminative effect is stronger in vivo than in vitro.

　　Key words:Senecio scandens Buch-Ham;   Escherichia coil;   R plasmids;   Elimination

　　大腸埃希菌作為條件致病菌是醫院內感染最常見病原菌之一，其耐藥菌株引起的感染日益增多。細菌的耐藥性由染色體或耐藥質粒(R質粒)介導，耐藥質粒可通過接合、轉化、轉導等方式在不同菌種之間傳遞，使敏感菌成為耐藥株，造成了R質粒的流行［1］。影響R質粒傳播的因素主要是由於抗生素的濫用，即抗生素的使用起到了選擇作用，使含有R質粒的菌株得以生存、擴增。將R質粒從宿主菌中消除，使其恢複對抗生素的敏感性，是臨床治療多重耐藥菌感染的新思路［2］。用人工方法消除R質粒國內外曾有報道［3］。本實驗用中藥千裏光水浸液作為消除劑，對大腸埃希菌R質粒進行體內、體外消除實驗，觀察千裏光對耐藥質粒的消除作用，探討其臨床應用的可能性。

　　1  材料

　　1.1  菌株　

　　大腸埃希菌(E.coil)，從贛南醫學院第一附屬醫院尿路感染患者尿中分離並鑒定為大腸埃希菌。

　　1.2  藥品與試劑　

　　千裏光購於江西贛南醫學院附屬醫院中藥房，取幹燥生藥50 g，加適量水煮沸30 min，過濾，藥渣再加水煮沸30 min，過濾，合並兩次濾液，濃縮到50 ml，即得1 g/ml千裏光水浸液。營養瓊脂為上海醫學化驗所產品；LB肉湯培養基(每毫升中含蛋白腖1 g，酵母抽提物5 g，氯化鈉5 g，葡萄糖1 g，pH7.2)；十二烷基硫酸鈉(SDS)購於華美生物工程公司；四環素（TC）、氨苄青黴素(AP)、鏈黴素(SM)均係國產標準品。

　　1.3  動物　

　　昆明小鼠30隻，6～8周齡，體重18～20g，雌雄不限，由贛南醫學院實驗動物部提供。

　　2  方法

　　2.1  實驗菌耐藥性測定　

　　以平板稀釋法［4］測定各抗生素對大腸埃希菌的最小抑菌濃度(Minimal inhibitory concentration，MIC)。

　　2.2  體外消除實驗　

　　按文獻［5］方法進行。將大腸埃希菌接種於 LB肉湯培養基中，37℃過夜振蕩培養，調菌液濃度1.5×109cfu/ml。取菌液5 μl分別加入含不同濃度千裏光(自100 mg/ml開始，倍比稀釋至第7管，第8管不加藥為空白對照管)的LB肉湯培養基中，每管LB培養基總量為1 ml。37℃振蕩培養24，48，72 h後取出，觀察細菌生長現象，判定亞抑菌濃度。從亞抑菌濃度管中取50 μl菌液分別劃線接種於10塊4%瓊脂平板培養基上，37℃培養24 h，待長出單個菌落後，挑取單個菌落1 000個，以影印培養法，依次轉接於含TC(20μg/ml)，SM(40 μg/ml)或AP(20 μg/ml)的藥物平板上以及不含藥物的4%營養瓊脂平板培養基上，37℃培養24 h，觀察並記錄結果。挑取在無藥平板上生長而在含藥物平板不長的菌落，即初步確定為R質粒消除子，再經相同抗菌藥物平板複試以後，最後確定為R質粒消除子。將搜集到的消除子與原菌液同時按文獻［6］快速抽提質粒DNA，0.7%瓊脂糖凝膠電泳，以檢測質粒帶的消失情況。另設SDS陽性對照組和空白對照組，消除實驗方法同上。

　　2.3  體內消除實驗 

　　2.3.1  建立大腸埃希菌腸道感染的小鼠模型［7］將實驗用小鼠均置消毒過的塑料籠內於無菌箱內飼養。第1天，每隻小鼠經灌胃法給四環素5 mg，紅黴素1 mg，8 h後給利福平6 mg。另外，飼以經高壓滅菌的飲料塊和含四環素(0.5 mg/ml)，紅黴素(0.01 mg/ml)的無菌飲水。第2～3天每隻小鼠給利福平6 mg，第4～5天每隻小鼠給四環素2 mg，用大腸埃希菌 (菌液濃度1.5×109 cfu/ml) 0.2 ml/隻經口感染，飲水和飲料同前。

2.3.2  大腸埃希菌R質粒的消除從第6天起將模型小鼠隔離，並隨機分6組，即3個實驗組及相應對照組，每組5隻。實驗組灌胃給予千裏光水浸液(每隻2 mg/d)，對照組不給任何藥物。同時，所有小鼠均禁食，但給經煮沸消毒的含蔗糖(10%)、氯化鈉(0.8%)、碳酸氫鈉(0.10%)的飲水。給藥後分別於24，48，72 h後處死小鼠，取盲腸內容物接種在4%營養瓊脂平板培養基上，37℃培養24 h，分離單個菌落，每組隨機挑取1 000個菌落影印培養，計數消除子數，再經質粒抽提，瓊脂糖凝膠電泳鑒定，步驟同上。

　　2.4  統計學分析

　　各組實驗數據釆用SPSS 10.0統計軟件處理，進行采用χ2 檢驗。

　　3  結果

　　3.1  大腸埃希菌對抗生素耐藥性檢測結果 

　　TC，SM，AP對大腸埃希菌MIC均>800 μg/ml，呈高度耐藥，千裏光對大腸埃希菌MIC為12.5 mg/ml。

　　3.2  體外消除實驗

　　千裏光體外作用大腸埃希菌24 h後，其消除結果與空白對照組比較，無明顯差異(P>0.05)；體外作用48 h與72 h後，其消除結果與空白對照組比較，有極顯著性差異(P<0.01)，表明千裏光體外有消除大腸埃希菌R質粒作用，但其消除作用低於SDS對照組(P<0.01) 。結果見表1。表1  千裏光水浸液作用不同時間後對大腸埃希菌R質粒體外消除的影響（略）

　　3.3  體內消除實驗 

　　千裏光體內作用大腸埃希菌24h，其消除結果與對照組經卡方檢驗P>0.05，無顯著性差異； 48 h與72 h消除結果經卡方檢驗P<0.01，有極顯著性差異，表明千裏光體內對大腸埃希菌R質粒也有消除作用。結果見表2。表2  千裏光水浸液作用不同時間後對大腸埃希菌R質粒體內消除的影響（略）

　　3.4  消除R質粒的表型千裏光在小鼠體內R質粒的消除實驗中，試驗菌株的耐藥性可表現為單一或多重(二耐以上)耐藥性的丟失，而體外消除實驗和對照組R質粒的丟失表現為單一耐藥性的丟失。

　　3.5  消除子的質粒檢測結果　

　　原始株與消除子經堿裂解法快速抽提質粒DNA，瓊脂糖凝膠電泳觀察發現消除子均都丟失1至數條質粒帶，表明在千裏光作用下，質粒被消除。

　　4  討論

　　質粒編碼所產生的細菌耐藥性和毒力等問題，給人類疾病治療帶來了很大困難，腸道耐藥基因庫的存在是腸道致病性耐藥菌株流行的潛在危險。消除耐藥質粒，使耐藥菌株恢複敏感性，對於治療臨床上由耐藥菌導致的感染和阻斷耐藥性和毒力的傳播都有非常重要的意義。

　　質粒具有自然丟失與人工消除的特性，但R質粒自發消除很緩慢，其消除頻率為10-2～10-8［8］。自20世紀60年代以來，人們發現各種理化因素均可消除R質粒，如高溫培養、紫外線照射、電穿孔法、SDS、高溫SDS雙重處理、嗅化乙錠、丫啶橙等可影響R質粒消除，抗生素也具有R質粒消除作用［3］。R質粒消除後細菌的耐藥性也隨之喪失，R質粒與染色體突變不同，R質粒消除後其耐藥性不再恢複，除非外源R質粒再次轉入，但由於這些物理化學因素對人體均有較強的毒副作用，不便投入臨床應用［3］。中藥屬於天然植物藥，毒副作用小，應用安全。中藥的質粒消除研究始於20世紀80年代，1983年徐建國等報道用黃連素消除去汙染小鼠體內痢疾杆菌的R因子；1985年陳小英［2］報道用大黃素消除金黃色葡萄球菌的耐藥質粒，此後陸續有相關研究報道，但多為抗菌能力強的清熱解毒或清熱燥濕類中藥。本實驗選用的千裏光為對大腸埃希菌具有較強抑製作用的清熱解毒類中藥，MIC為12.5 mg/ml，故選其作為消除劑。結果表明：千裏光對大腸埃希菌R質粒具有消除作用，且體內消除作用強於體外，其可能原因是在體內細菌不僅受到藥物的作用，同時受到機體的內環境，特別是免疫因素影響。R質粒的消除不僅表現為單一耐藥性的丟失，還表現為多重耐藥性的丟失；消除R質粒最佳時間為體外48 h(P<0.01)，體內72 h (P<0.01)。

中藥千裏光在臨床上不但可用於體外，也可用於體內，其抗菌能力的強弱與其對細菌質粒消除率的大小之間是否存在相關性還不清楚，因此有關千裏光水浸液對R質粒的消除機製有待進一步研究。

   作者：張文平 曹鎬祿 張文書 黃真 《時珍國醫國藥》

【參考文獻】

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　　［4］George M，Eliopoulos，Robert C，et a1．Antimicrobial Combinations［M］.Antibootics in Laboratory Medicine,4th ed,1996：330．

　　［5］陳 群, 陳菊南,王勝春.黃連對大腸杆菌R質粒消除作用的實驗研究［J］.中國中西醫結合雜誌, 1996,16(1):37.

　　［6］金冬燕, 黎盂楓. 分子克隆實驗指南，第2版［M］. 北京：科學出版社，1992：19.

　　［7］劉 克, 關 鍵, 李菁華, 等. 黃芩甙對銅綠假單胞菌R質粒的消除作用［J］.微生物學雜誌, 2003,23(2)：49.

［8］陸德源 .醫學微生物學，第4版［M］. 北京：人民衛生出版社, 1996：50.

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