紫草不同提取物抗炎及抑菌作用實驗研究

【摘要】  　　目的探討紫草不同濃度的醇提物和水提物體內抗炎作用和體外抑菌作用。方法采用Kirby-Baue紙片擴散法，測定紫草不同濃度的醇提物及水提物對金黃色葡萄球菌、奇異變形杆菌、大腸杆菌、白色念珠球菌、銅綠假單胞菌、無乳鏈球菌、福氏Ⅱ型杆菌的抑製效果。采用二甲苯致小鼠耳部腫脹法，測定紫草不同濃度的醇提物和水提物的抗炎作用。結果①與陽性對照比較：在各種不同提取物中，80%的乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、福氏Ⅱ型杆菌、無乳鏈球菌的抑製作用達到最強，抑菌圈直徑分別為(11.17±1.26)、(10.33±1.54）和（18.67±2.08）mm，其中對無乳鏈球菌的抑製作用接近陽性對照藥紅黴素［紅黴素的抑菌圈直徑為（19.67±1.52）mm］；50%乙醇提取物和20%乙醇提取物的抑菌作用相對較弱。水提物對白色念珠球菌有較好的抑製作用，抑菌直徑為（7.83±0.29）mm；各種提取物對大腸杆菌均無抑製作用。②紫草提取物的抗炎作用與濃度呈正相關；紫草醇提物ZCE-I（含生藥0.06g/ml）、ZCE-II（含生藥0.03g/ml）的抑製率分別為68.91%（P<0.01）和15.87%（P<0.05），而紫草水提物ZCW-I（含生藥0.15g/ml）和ZCW-II（含生藥0.06g/ml），是醇提物ZCE-I和ZCE-II的生藥量的2.5倍和2倍，但抑製率僅為17.08%（P<0.05）和0.58%（P>0.05），是ZCE-I和ZCE-II抑製率的25%和0.04%；說明紫草醇提物的抗炎效果好於水提物的抗炎效果。結論紫草不同濃度的醇提物和水提物具有較強的抗炎抑菌作用；首次通過實驗闡明了紫草抑菌作用的活性部位及抑菌強度。

【關鍵詞】  紫草； 二甲苯致小鼠耳部腫脹法； Kirby-Baue紙片擴散法； 活性部位

　　Abstract：ObjectiveTo study the anti-inflammatory effects（in vivo）and antibacterial effects（in vitro）of different concentration ethanol and water extracts from Lithospermum erythrorhizon.MethodsKirby-Bauer paper dispersion method was adopted to determine the antibacterial effects against Staphylococcus aureus,Proteus mirabilis,Escherichia coli,Candida albicans,Pseudomonas acruginosa,Streptococcus agalactiae,Shigella flexneri II. The method of xylene -induced ear swelling in mice was used to determine the anti-inflammatory effects of different ethanol and water extracts. Results①Compared with the positive control, the 80% ethanol extract showed the best antibacterial effects against Staphylococcus aureus,Shigella flexneri II and Streptococcus agalactiae, the antibacterial diameters were 11.17±1.26mm,10.33±1.54mm and 18.67±2.08mm, of which for anti-Streptococcus agalactiae effect was approach to the positive control drug erythromycin（the antibacterial diameter of erythromycin is 19.67±1.52mm）.The anti-inflammatory effects of the 50% ethanol and 20% ethanol extracts were weak relatively. The water extract had better anti-Candida albicans effect, the antibacterial diameter was 7.83±0.29mm. Every kind of extracts had inefficacy on Escherichia coli. ②The anti-inflammatory effect of extracts was positive correlated with concentration. The inhibitory rate of ethanol extracts ZCE-I（dosage 0.06g/ml）,ZCE-II（dosage 0.03g/ml） were 68.91%（**P<0.01） and 15.87%（*P<0.05）, the dosages of water extracts（ZCW-I/dosage 0.15g/ml,ZCW-II/dosage 0.06g/ml）） were 2.5 and 2 times of ethanol extracts, but the inhibitory rate were 17.08%（*P<0.05）and 0.58%（P>0.05），was 25% and 0.04% of the inhibitory rate of ZCE-I and ZCE-II；showing that the anti-inflammatory of the ethanol extracts are better than the water extracts. ConclusionThe ethanol and water extracts from Lithospermum erythrorhizon have strong anti-inflammatory and antibacterial effects. It is the first time that the antibacterial effective part and strength of Lithospermum erythrorhizon is elucidated through the experiments.

　　Key words：Lithospermum erythrorhizon；  Method of xylene causing the swelling ear in mice；  Kirby-Bauer paper dispersion method；  Effective part

    紫草是我國民間常用的中草藥，以根入藥。《中國藥典》收藏的紫草有3個品種，即紫草科植物紫草Lithospermum erythrorhizon Sieb.et zucc，新疆紫草Arnebia euchroma，pahnst，內蒙紫草Arnebia gutlata Bunge。新疆軟紫草Arnebia euchroma（Royle） Johnston別名新疆紫草、新疆假紫草，其化學成分與硬紫草極為相似，紫草素及其衍生物的含量比硬紫草高8倍，被列為正品，在傳統中藥處方中用作抗炎、退熱和抗菌藥［1，2］。紫草的有效成分主要為兩大類：一類是脂溶性很強的萘醌類色素，另一類是水溶性成分，主要是多糖，含量在2%左右［3］。現代藥理學研究表明［4～7］，紫草還具有較好的抗生育、抗氧化、抗腫瘤、降血糖、保肝護肝和對心血管係統的作用。由於臨床應用廣泛且對一些疑難雜症的治療顯現出較好的療效，紫草一直受到廣大藥物工作者的重視。為了提高紫草在傳統用藥中的療效，現對新疆軟紫草的不同濃度的醇提物及水提物的抗炎和抑菌作用進行體內、體外實驗研究，進一步明確紫草不同提取溶劑製備的活性部位發揮不同的藥理作用，為最大限度地開發紫草的藥理作用提供可靠的實驗依據。

　　1  器材與方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  藥材新疆紫草，購於山東甄城良還中藥飲片有限公司（產地：新疆）。

　　1.1.2  動物昆明種健康小鼠，70隻，雄性，體重18～22 g（泰山醫學院實驗動物中心提供）。

　　1.1.3  菌種金黃色葡萄球菌、奇異變形杆菌、大腸杆菌、白色念珠球菌、銅綠假單胞菌、無乳鏈球菌、福氏Ⅱ型杆菌（泰山醫學院附屬醫院檢驗科提供）。

　　1.1.4  試劑和儀器營養瓊脂（天津市英博生化世紀有限公司），藥敏片（紅黴素、複方新諾明、阿米卡星、氨苄青黴素、環丙沙星、氟呱酸、氯黴素等）（北京太洋藥業有限公司），其它試劑均為國產分析純；旋轉蒸發儀（上海亞榮生化儀器廠），分析天平（made for ohaus corp pine Brook NJ.USA），TMQ.R-3250自動台式滅菌器（山東新華醫療器械股份有限公司），超淨台（蘇州淨化設備有限公司），HHB11電熱恒溫培養箱（天津市實驗儀器廠），0.45 μm濾膜（上海亞淨化器材廠），過濾器（上海瑞麗分離儀器廠），小鼠灌胃器，6.0 mm打孔器，微量加樣器（上海求精生化試劑儀器有限公司）。

　　1.2 方法

　　1.2.1 抑菌實驗

    紫草不同濃度醇和水提物的製備：分別稱取紫草粉末10 g，以80%的乙醇、50%的乙醇、20%的乙醇以及純淨水各80 ml浸泡3 h。將其放入超聲振蕩儀中，在40℃，100%的功率下，超聲1 h，過濾，取其濾液。然後以1∶5的比例分別以同樣的設置超聲提取30 min，取其濾液。合並兩次濾液，1 000 r/min離心30 min，取上清液，抽濾，將濾液用旋轉蒸發儀蒸發濃縮，分別移至5 ml的容量瓶中定溶，標記，規定此溶液濃度為100%（生藥含量2 g/ml）。分別在定容的各種紫草提取液中移出一定量的液體，用蒸餾水稀釋至原濃度的50%（生藥含量1 g/ml）及10%（生藥含量0.2 g/ml）。標記待用。

　　Kirby-Baue紙片擴散法：以藥敏片做陽性對照，生理鹽水浸潤的濾紙片作陰性對照。放入25℃的培養箱中培養24 h，用數顯遊標卡尺測量抑菌圈的直徑(包括貼片),並記錄測量數據，每組實驗重複3次。判斷標準：抑菌圈直徑大於6 mm者判為有抑菌作用；抑菌圈直徑小於或等於6 mm者判為無抑菌作用；3次重複試驗均達到有抑菌作用結果者判為合格。陰性對照組應無抑菌圈產生，否則實驗無效［8］。抑菌圈直徑大於6 mm小於10 mm為低度敏感；大於10 mm小於15 mm為中度敏感；大於15 mm為高度敏感。

1.2.2 抗炎實驗

    紫草醇提物、水提物的製備：分別取紫草90 g，以紫草∶無水乙醇或蒸餾水為1∶15的比例，回流提取1 h，過濾；再重複上述操作分別回流提取45 min和30 min。合並的濾液，用旋轉蒸發儀濃縮至浸膏，加入生理鹽水50 ml製備紫草醇提液ZCE-I（含生藥0.06 g/ml）、ZCE-II（含生藥0.03 g/ml）和水提液ZCW-I（含生藥0.15 g/ml）、ZCW-II（含生藥0.06 g/ml）。

　　二甲苯致小鼠耳部腫脹法：雄性小鼠70隻，隨機分組，共3個大組，即紫草醇提物組，紫草水提物組，生理鹽水組（Control）；其中前兩個大組每組又分為兩個小組，分別為紫草醇提物ZCE-I，ZCE-II濃度組，紫草水提液ZCW-I，ZCW-II濃度組。每小組10隻小鼠。每組小鼠用相應的藥物或生理鹽水灌胃（0.3 ml/10 g）；灌胃45 min以後，用50 μl 微量加樣器塗二甲苯50 μl 於小鼠右耳正反兩麵；20 min後，脫臼處死小鼠，沿耳廓基線剪下雙耳，用內徑6 mm的打孔器於同一部位打孔，取下耳片，稱重，計算左右耳重量差異及計算抑製率。

　　2 結果

　　2.1  紫草不同濃度醇和水提取物的抑菌作用與陽性對照比較，紫草的各種提取物均有一定的抑菌作用，並隨提取物濃度的降低，抑菌效果減弱；其中80%的乙醇提取物對金黃色葡萄球菌、福氏Ⅱ型杆菌、無乳鏈球菌的抑製作用最強，抑菌圈直徑分別為（11.17±1.26）mm（中度敏感）、（10.33±1.54）mm（中度敏感）和（18.67±2.08）mm（高度敏感），其中對無乳鏈球菌的抑製作用接近陽性對照藥紅黴素［紅黴素的抑菌圈直徑為（19.67±1.52）mm］。50%乙醇提取物和20%乙醇提取物的抑菌作用相對較弱。不同提取物對白色念珠球菌有一定抑製作用，其中水提物對白色念珠球菌有較好的抑製作用，抑菌直徑為（7.83±0.29）mm（低度敏感）；水提物對奇異變形杆菌的抑製作用相對於醇提物也是最強的。與常用的大腸杆菌抑菌藥氟呱酸（抑菌圈直徑平均達到23.8 mm）比較，各種提取物對大腸杆菌均無抑製作用。結果見表1～2。表1  紫草醇提物和水提取物的抑菌作用（略）表2  紫草提取物抑菌定性實驗結果（略）

　　2.2 紫草醇提物和水提物對二甲苯所致小鼠耳部腫脹的影響紫草醇提物組ZCE-I（含生藥0.06 g/ml）和ZCE-II（含生藥0.03 g/ml）與生理鹽水組比較均有統計學意義（P<0.01或P<0.05），表明不同濃度的紫草醇提物均能降低小鼠耳腫脹度，有抗炎作用。由抑製率看，ZCE-I的抗炎作用最大，抑製率為68.91%，ZCE-II的抗炎效果偏低，抑製率為15.87%。結果見表3。

　　紫草水提液組ZCW-I（含生藥0.15 g/ml）與生理鹽水組比較有統計學意義（P<0.05），而ZCW-II（含生藥0.06 g/ml）與生理鹽水組比較差異不顯著（P>0.05），表明較高濃度的紫草水提液能降低小鼠耳腫脹度，有抗炎作用，而低濃度的紫草水提液幾乎無抗炎作用。抑製率表明抗炎作用強弱，紫草水提液組ZCW-I為17.08%，隨著提取液濃度的降低，抗炎作用減弱，紫草水提液組ZCW-II的抑製率為0.58%，說明此濃度下已基本無抗炎作用。結果見表3。表3  紫草醇提物和水提物對二甲苯所致小鼠耳部腫脹的影響（略）

　　3 討論

    從實驗結果看，紫草各種提取物均有一定程度的抑菌作用。其中高濃度的乙醇提取物的抑菌效果最好，如80%乙醇提取物對無乳鏈球菌的抑製作用最強，接近陽性對照藥紅黴素的抑製效果。不同提取物對白色念珠球菌有一定抑製作用，其中以水提物的抑製作用最強，說明紫草的水提物對真菌有抑製作用。所有提取物均對大腸杆菌無效。所以在利用紫草治療細菌引起的感染時，應選用高濃度的乙醇作為提取溶劑，製備其有效部位用於抗菌的治療；如果選用紫草進行真菌類感染的治療，應選用水作為提取劑，製備其水煎劑用於疾病的治療。

藥理實驗表明，皮下注射紫草素（shikonin）10 mg/kg，對小鼠巴豆油耳炎症和大鼠酵母性足趾腫有明顯抑製作用［1］。本研究以二甲苯作為致炎因子，通過小鼠耳廓水腫實驗進一步證明了紫草的水提物及醇提物均有一定的抗炎作用；紫草的抗炎作用與濃度具有一定的相關性，在一定濃度範圍內，其抗炎作用與給藥濃度呈正相關；紫草醇提物的抗炎效果好於水提物，所以在提取中藥材中活性成分時，應根據其溶解特性選擇適宜的提取溶劑，將有效成分以最大量提取出來。因此，進行紫草抗炎和抗菌作用的實驗研究，具有指導意義。

作者：趙雪梅，鄧文，李瑩，王桂玲，費洪榮，張穎，陳偉《時珍國醫國藥》

【參考文獻】

  　　［1］王文傑,白金葉,劉大培.紫草素抗炎及對白三烯β4生物合成的抑製作用［J］.藥學學報,1994,29（3）:161.

　　［2］吳壽金,趙 泰,秦永祺.現代中草藥成分化學［M］.北京:中國醫藥科技出版社,2002:146.

　　［3］Fukui H,Hasan A F M F,Ueoka T，et al．Formation secretion of a new brown benzoquinone by hairy root cultures of Lithospermum erythrorhizon［J］.Phytochemistry,1998,47（6）:1037.

　　［4］謝冰芬,馮公侃,黃 河,等.天然紫草萘醌類化合物及其衍生物的抗瘤作用研究［J］.中國藥理學通報,2006,22（4）:505.

　　［5］彭宗根,陳洪珊.紫草酸B的藥理作用研究進展［J］.中國藥學雜誌,2003,38（10）:744.

　　［6］吳振,吳立軍,田代真一,等.紫草素誘導A375-S2細胞凋亡的分子機製研究［J］.中國藥理學通報,2005,21（2）:202.

　　［7］吳振,吳立軍,田代真一,等.紫草素誘導HeLa細胞凋亡經過caspase激活的機製［J］.中國藥理學通報,2004,20（5）:540.

［8］衛生部衛生法製與監督司.消毒技術規範［S］.北京:中華人民共和國衛生部,2002:48.

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