【摘要】 目的考察丹參中水溶性成分與脂溶性成分的含量及其抑菌作用。方法采用HPLC法測定丹參素、原兒茶醛和丹參酮ⅡA含量；以平板二倍稀釋法統計最小抑菌濃度（MIC），探討其體外抑菌作用。結果丹參水溶性成分和脂溶性成分均對金黃色葡萄球菌標準株、臨床株；大腸埃希菌標準株；銅綠杆菌標準株；大腸杆菌臨床株1、臨床株2有抑菌作用，兩種抑菌藥液均對金黃色葡萄球菌標準株、臨床株作用最強，對大腸埃希菌標準株作用相對較弱；水溶性成分的抑菌作用強於脂溶性成分。結論丹參水溶性成分與脂溶性成分均具有一定的抑菌活性，提示該作用可進一步開發利用。
【關鍵詞】 丹參 丹參素 原兒茶醛 丹參酮ⅡA 抑菌
Abstract:ObjectiveTo investigate the content of liposoluble and hydrosoluble constituents in Salvia miltiorrhiza Bge. and its antibacterial effect．MethodsThe contents of danshensu,protocateehualdehyde and salviolⅡA were determined by HPLC and the antimicrobial effect was obseved according to MIC by the method of plate doubling-dilution．ResultsThe liposoluble and hydrosoluble constituents of Salvia miltiorrhiza Bge. had some inhibition on all bacterial species in our experiments, especially the strongest on Staphylococcus aureus，the weakest on Bacillus coli; moreover, the hydrosoluble constituent had stronger effect than the liposoluble one.ConclusionThe antibacterial active components of Salvia miltiorrhiza Bge. need to make better use.
丹參Salvia miltiorrhiza Bge.屬唇形科植物，其藥用部位為幹燥根及根莖，味苦，性微寒［1］，歸心、肝經，具有祛淤止痛、活血通經、清心除煩等功效［2］，臨床廣泛用於活血化瘀、寧心安神、抗菌消炎和心腦血管疾患等症，是國內外現代化中藥研究的熱點品種之一［3］。丹參的化學成分主要為水溶性成分和脂溶性成分兩部分。本文比較了多種提取方法，建立了從同一樣品中分步先後提取脂溶性與水溶性成分，並應用高效液相色譜法優化篩選了色譜條件，使之在同一梯度條件下完成丹參中3種活性成分丹參素、原兒茶醛和丹參酮ⅡA的定量分析。丹參有關心血管方麵的藥理研究已相當深入，但其抑菌方麵的研究報道較少，多為水煎液或對照品丹參酮ⅡA的抑菌報道，未見丹參的抑菌有效部位及其成分的抑菌研究。本實驗先於定量之後，準確把握抑菌濃度再行相關抑菌研究,以期為臨床應用其抗菌消炎作用提供科學依據。
1 儀器與材料
美國SSI高效液相色譜儀，分析之星色譜工作站，乙腈為色譜純、水為雙蒸水、磷酸為分析純。丹參素鈉對照品，原兒茶醛對照品，丹參酮ⅡA對照品(中國藥品生物製品檢定所)。丹參藥材購自天津中藥飲片廠（經天津中醫藥大學第一附屬醫院尚英和藥師鑒定）。
金黃色葡萄球菌標準株，臨床株；大腸埃希菌標準株；銅綠杆菌標準株；大腸杆菌臨床株1，臨床株2(均由天津醫科大學微生物教研室提供)。
2 方法和結果
2.1 水溶性成分丹參素、原兒茶醛和脂溶性成分丹參酮ⅡA的測定
2.1.1 色譜條件色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相A:0.4%磷酸水溶液，流動相B:乙腈，流速為1.0 ml/min，檢測波長為275 nm，柱溫40℃,梯度洗脫：0～10 min，4%B；10～16 min，10%B；16～20 min,15%B；20～30 min,20%B；30～50 min,70%B；50～58 min,100%B。
2.1.2 對照品溶液的製備精密稱取一定量原兒茶醛、丹參素鈉對照品，各置10 ml棕色容量瓶中，加70％甲醇定容，均配成1 mg/ml溶液，後者相當於丹參素0.875 mg/ml，另稱一定量丹參酮ⅡA對照品，以甲醇溶解按上述方法配成0.232 2 mg/ml的溶液；分別吸取丹參素鈉、原兒茶醛和丹參酮ⅡA標準溶液各400，25，60 μl於1 ml容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，即得0.4 mg/ml丹參素鈉、0.025 mg/ml原兒茶醛和0.013 93 mg/ml丹參酮ⅡA的混合對照品溶液(10℃以下保存)。
2.1.3 供試品溶液的製備取丹參藥材置烘箱中50℃幹燥，粉碎過60目篩。精密稱取幹燥粉末4 g，加95%乙醇100 ml於圓底燒瓶中,以索氏提取器提取1 h，控製溫度75℃，收集提取液於100 ml容量瓶中，加乙醇稀釋至刻度，搖勻，得脂溶性部位提取液。再加蒸餾水150 ml於圓底燒瓶中，在索氏提取器中繼續提取16 h，注意控製溫度保持微沸狀態，濃縮提取液轉至100 ml容量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻即得水溶性部位提取液，備用。各取以上提取液0.5 ml，混勻作為供試品溶液。
2.1.4 標準曲線的製備精密吸取“2.1.2”項下混合對照品溶液3，4，6，8，12，14 μl進樣測定，以峰麵積為縱坐標，質量為橫坐標繪製標準曲線，計算丹參素、原兒茶醛、丹參酮ⅡA三者的回歸方程分別為Y=334 759X-55 813（r=0.999 4）；Y=4E+06X-49 201（r=0.999 6）；Y=5E+06X+1 804.9（r=0.999 4）；知三者分別在1.2～5.6 μg，0.075～0.35 μg，0.042～0.20 μg範圍內與峰麵積線性關係良好。
2.1.5 精密度實驗精密吸取同一混合對照品溶液10 μl，重複進樣6次，測定峰麵積，三者RSD分別為1.63%，1.34%，1.71%。結果表明，儀器精密度良好。
2.1.6 含量測定依法測定混樣中脂溶性成分丹參酮ⅡA的含量為105.29 μg/ml，水溶性成分丹參素、原兒茶醛含量依次為347.6，290.4 μg/ml。
2.2 體外抑菌作用
2.2.1 藥液的製備 將“2.1.3”項水溶性部位供試液，作為水溶性部位抑菌藥液；同前將脂溶性部位供試液旋蒸，除盡乙醇溶劑後，以生理鹽水溶解至1/4體積，作為脂溶性部位抑菌藥液，備用。
2.2.2 培養基的配製 將MH瓊脂加水煮沸融化後，分裝於試管內，每管20 ml，高壓滅菌（121℃）1 h，取出後，置於80℃水浴，備用。
2.2.3 含藥瓊脂平板製備根據實驗設計，將已倍比稀釋的不同濃度的抑菌藥液分別加入已平衡的瓊脂中充分混勻傾倒至滅菌平皿，瓊脂厚度約4 mm。另設蒸餾水代替藥液為陰性對照。
2.2.4 接種菌的製備 分別從保存菌種的培養基斜麵上將上述各菌株移至培養基中,37℃培養18 h，製備濃度相當於0.5麥氏標準比濁管的菌懸液，相當於1.5×108/ml，在15 min之內接種。
2.2.5 瓊脂稀釋法進行最低抑菌濃度的抑菌評價用移液器取已校正濃度的待測菌液2 μl，滴加於含藥瓊脂表麵，使用接種環將每一接種點直徑控製在5~8 mm之間，待接種物被培養基吸收後，將平板置於35℃培養箱中，倒置培養18 h後觀察結果。每個實驗重複3次。凡肉眼無細菌生長的藥物最低濃度為最低抑菌濃度（MIC）。
2.2.6 抑菌結果由表1可見，丹參水溶性成分和脂溶性成分均對金黃色葡萄球菌標準株、臨床株；大腸埃希菌標準株；銅綠杆菌標準株；大腸杆菌臨床株1、臨床株2有抑菌作用，兩種抑菌藥液均對金黃色葡萄球菌標準株、臨床株作用最強，對大腸埃希菌的標準株作用相對較弱。另外發現，水溶性成分的抑菌作用強於脂溶性成分。
表1 丹參水提液和醇提液的抑菌結果（略）
3 討論
3.1 抑菌藥液提取方法的比較對於脂溶性成分提取方法的篩選，先後考察了以乙醇作溶劑的索氏提取、熱提及超聲提取3種方法，其中索式提取含量最高，熱提居中，超聲提取最低，故本實驗采用索式提取法。實驗中還發現索提1h丹參酮ⅡA的含量高於2h，故確定1h提取，這可能與丹參酮ⅡA受熱過長分解有關。對於水溶性成分提取方法的篩選，主要以水作溶劑比較了上述3種方法，其中也以索提最佳，提取時間根據HPLC分析，16 h提取完全。
3.2 色譜條件的優化2005版《中國藥典》對於水溶性成分和脂溶性成分的含量測定，分別采用不同的色譜條件進行分析，本文經多次實驗篩選，建立了同一色譜條件下同時測定水溶性成分丹參素、原兒茶醛及脂溶性成分丹參酮ⅡA3種成分含量的方法。實驗中曾嚐試了4種梯度，梯度比依次為①0～10 min，4%B;10～50 min，80%B;50～53 min,100%B；② 0～10 min,4%B；10～15 min,6%B；15～50 min,80%B；③0～10 min，4%B；10～16 min,16%B；16～20 min,26%B;20～25 min,30%B；25～50 min,80%B;50～53 min，100%B；第4梯度同前述。其主要區別在於10～50 min的兩相配比的梯度變化不同。第1梯度，A相降低迅速，流動相極性變弱，水溶性峰堆積；第2梯度，雖增加一過渡平台，但流動相極性變化還是過快，峰形仍有疊加現象；第3梯度，流動相極性變化又過緩，不僅使脂溶性成分拖後，且與相鄰峰重疊，采用第4梯度，水溶性成分保留時間恰當，脂溶性成分分離完全，峰形良好。
3.3 丹參抑菌活性實驗的比較與以往文獻對比［4，5］，丹參抑菌活性實驗多采用水煎液或對照品丹參酮ⅡA作為抑菌藥液，前者除裹帶了過多雜質，還未提出脂溶性成分，即實際上降低了有效的抑菌濃度，導致最低抑菌濃度實驗結果偏高；後者僅利用脂溶性成分，尚缺水溶性抑菌成分，也是不完全的實驗結果。本實驗從丹參中既提取水溶性成分又提取脂溶性成分，再進行抑菌試驗，不僅成分確切，且濃度低於文獻濃度［4］，這可能由於索提時丹酚酸類物質長時間受熱水解為遊離的丹參素，增加了抑菌活性的緣故。
作者：周靜 李惠芬 王洪誌 駱達 杜凡 王宇歆 吳鹹中《時珍國醫國藥》
【參考文獻】
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［3］ 張興國,程方敘,張 稷,等.貯藏期對丹參的總酮含量及抑菌效力的影響研究［J］.特產研究,2005,4:27.
［4］ 孫吉蘭,常雲亭,宋海英,等.丹參的體外抑菌作用研究［J］.時珍國醫國藥,2003,14(12):725.
［5］ 朱嘉蓉,羅厚蔚.丹參酮ⅡA的抑菌活性研究［J］.中國藥科大學學報,2004，35(4)：368.
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