【摘要】 目的 觀察天然抗生素肽elafin與銅綠假單胞菌的相互作用。方法體外細胞培養氣道上皮A549細胞，將已構建好elafin克隆載體通過脂質體轉染係統轉染到A549細胞中，空質粒載體作為其對照，倒置熒光顯微鏡觀察轉染效果。空載體轉染A549細胞(正常組)以及轉染後的A549細胞分別用細胞培養液(對照組)和銅綠假單胞菌上清液(實驗組)繼續孵育24h。用ELISA法檢測每組細胞上清液中elafin水平，Western Blot法檢測細胞內elafin含量；孵育24h後，每組上清液取1ml加入到銅綠假單胞菌菌懸液中培養24h，用倍比稀釋法測細菌數量。結果 對照組細胞的上清液中elafin水平(2.93±0.41)和細胞內elafin蛋白含量(0.23±0.05)，與正常組［(1.24±0.23)和(0.12±0.03)］有顯著差異(均為P<0.01)。上述指標實驗組［(8.54±0.99)和(0.74±0.18)］與對照組相比明顯增加(均為P<0.01)；對照組細胞上清液中細菌數量［(5.62±0.75)×106/ml］與正常組細胞上清液中的［(6.78±0.98)×106/ml］也有差異(P<0.05)，實驗組［(3.26±0.53)×106/ml］與對照組相比細菌數明顯減少(P<0.01)。細胞上清液中elafin水平與細菌數呈一定的負相關(r=-0.59，P<0.05)。結論 銅綠假單胞菌能誘導elafin產生，反之elafin亦有一定的殺銅綠假單胞菌作用。
【關鍵詞】 Elafin； 銅綠假單胞菌； 氣道上皮細胞
ABSTRACT Objective To observe the interaction of the natural antibiotic elafin and P.aeruginosa in airway epithelial cells. Methods After cultivating A549 cells in vitro, the constructed pEGFP-N1-elafin eukaryotic expression vector was transfected into the cells by LipofectamineTM 2000, and empty plasmid as a vector control. The A549 cells with pEGFP-N1-elafin vector were incubated for 24 hours in DMEM medium (control group), and the supernatant of P.aeruginosa (experimental group), and the cells with empty plasmid vector as normal group. The level of elafin secretion in supernatants and the content of elafin in the cells were detected by ELISA and Western Blot respectively. Meanwhile the supernatants (1ml) of the three groups after incubated 24 hours were added into the culture of P.aeruginosa, and at the same time, the number of bacteria of each group was detected by two-fold dilution method. Results The level of elafin secretion and the content of elafin in the cells in control group ［(2.93±0.41) and (0.23±0.05)］ were increased compared to normal group ［(1.24±0.23) and (0.12±0.03)］ (P<0.01), while those of experimental group ［(8.54±0.99) and (0.74±0.18)］ were obviously higher than those of in control group (P<0.01). The number of bacteria of normal group ［(6.78±0.98)×106/ml)］ and control group ［(5.62±0.75)×106/ml)］ were different (P<0.05), the number of the experimental group ［(3.26±0.53)×106/ml)］ was reduced significantly compared tocontrol group (P<0.01). The level of elafin secretion and the number of bacterial in supernatants were apparently in negative correlation. Conclustions P.aeruginosa could induce the production of elafin, and in turn, elafin had some inhibition activity against P.aeruginosa.
KEY WORDS Elafin; Pseudomonas aeruginosa; Airway epithelial cell
銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)引起的醫院感染(尤其是肺部感染)在近年已很常見，在很多大型醫院銅綠假單胞菌占分離菌的首位。銅綠假單胞菌引起的感染，因其很容易形成生物膜致使病原菌很難被清除，常常導致感染的反複發作，是難治性肺部感染的重要原因［1］。近來國外的研究顯示很多因素均可以誘導天然抗生素肽elafin表達增加，其除了作為蛋白酶抑製劑具有能夠抑製氣道黏液高分泌和對氣道上皮細胞的保護作用外，還具有抑殺銅綠假單胞菌的功能。本研究旨在通過觀察elafin重組到氣道上皮細胞後，Pa是否具有誘導elafin的作用，以及它與Pa有無相互作用，並了解elafin對呼吸道感染常見細菌的抗菌作用，為其治療Pa慢性肺部感染提供一定的理論依據。
1 材料與方法
1.1 細胞株、培養液及菌株
肺上皮細胞株A549由重慶醫科大學病理生理教研室保存；Dulbecco改良的Eagle培養基(DMEM，美國Gibco/BRL公司)，不含血清和抗生素的1640培養基(RPMI-1640，美國Gibco/BRL公司)；黏液型Pa菌株由重慶醫科大學附屬第二醫院細菌室
1.2 試劑
酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒(武漢博士德生物公司)，Western blot試劑盒(上海康成生物工程有限公司)，轉染試劑LipofectamineTM 2000(北京同正生物科技公司)，重組載體pEGFP-N1-elafin由本研究組楊捷博士克隆並構建［2］。
1.3 主要實驗儀器
24孔平板(天津塑料製品廠)，麥氏比濁儀(法國Bio-Merieux公司)，倒置熒光顯微鏡(Olympus IX-70)，薄層色譜掃描儀(CD60，德國Desaga公司)。
1.4 A549細胞的培養以及轉染
A549細胞常規複蘇後，加入適量含10%胎牛血清、1% L-穀氨酰胺及1%青黴素和鏈黴素的DMEM，置於
1.5 實驗分組與誘導孵育
①正常組：重組未含elafin基因空載體的細胞，在DMEM培養液孵育24h；②對照組：將重組後的細胞經DMEM培養液孵育24h；③實驗組：重組後的細胞加用Pa上清液(1.5×108CFU/ml的Pa菌懸液200μl在1.8ml MHB中孵育24h)0.5ml孵育誘導24h。
1.6 ELISA法檢測細胞上清液elafin水平
采用ELISA法檢測三組細胞孵育後的上清液中elafin水平。抗elafin IgG(1∶500)包被及後續步驟按ELISA試劑盒說明書操作，在ELISA檢測儀上，於450nm處，以空白對照孔調零後，各孔細胞上清液elafin相對水平用所測得的吸光度A值表示。
1.7 Western Blot檢測細胞內elafin含量
各組細胞孵育24h後，用0.01mol/L磷酸緩衝液清洗3遍，按常規方法提取蛋白，15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE，電壓200V，60min)分離蛋白質。分離後的蛋白按常規方法轉移至硝酸纖維素膜上、封閉，加入鼠抗elafin一抗，
1.8 上清液中細菌數的測定
各組細胞孵育24h的上清液1.0ml，分別加入到用MHB配製的1.5×108CFU/ml的Pa菌懸液1.0ml，置
1.9 統計學處理
采用SPPS10.0統計軟件，檢測結果均以x±s表示，組間差異的顯著性用方差分析的q檢驗，兩變量的相關程度用直性相關分析法分析，以P<0.05作為差異的顯著性。
2 結果
2.1 轉染後觀察elafin轉染情況
通過LipofectamineTM 2000將elafin克隆載體轉染到A549細胞，36h在熒光倒置顯微鏡下觀察到部分細胞出現綠色熒光，計數顯示轉染效率約為35%，空載體則未見熒光。
2.2 細胞elafin水平
不含elafin基因的空載體正常與細胞內含elafin的對照組相比，後者含elafin的水平明顯高(均為P<0.01)；而經銅綠假單胞菌上清液誘導後，實驗組比對照組含elafin水平則明顯升高(均為P<0.01)，結果見Tab.1。
2.3 上清液中細菌數的測定
對照組細菌數量(5.62±0.75)×106CFU/ml與空載體正常組(6.78±0.98)×106CFU/ml相比明顯偏低(P<0.05)；實驗組的細菌數(3.26±0.53)×106CFU/ml較對照組更低(P<0.01)，結果見Tab.1。
2.4 上清液elafin水平與細菌數的關係
細胞上清液elafin的水平與菌懸液中的活細菌數成負相關(r=-0.59，P<0.05)。
3 討論
Pa是廣泛分布於自然界的人類條件致病菌，它對正常人不致病，人對它的防禦機製為白細胞及黏膜纖毛係統局部屏障功能。Pa呼吸道感染常繼發於宿主免疫功能受損後，尤其易發於原有肺部慢性病變基礎上，如慢性支氣管炎、支氣管擴張、氣管切開、應用人工呼吸機後。Pa在慢性氣道炎症中常形成生物膜而抵抗常用抗生素的殺菌作用，形成持續感染，是難治性肺部感染的主要原因之一［3］。
本研究通過構建好的pEGFP-N1-elafin與陽離子脂質體轉染試劑LipofectamineTM 2000轉染到氣道上皮細胞中，倒置熒光顯微鏡觀察表明轉染成功，具有一定的表達效率。
Elafin在呼吸道主要是由Ⅱ型肺泡上皮細胞、Clara細胞以及肺泡巨噬細胞在炎性刺激誘導下表達［4］，細菌以及常見致炎因子及炎症反應順序產物均能誘導elafin的產生［5］。本研究顯示銅綠假單胞菌產物孵育後細胞上清液中elafin的含量以及細胞內elafin蛋白表達水平有增加，提示Pa具有明確的elafin表達誘導作用，且同時具有促分泌效應，說明它是肺組織保護性因子產生的有效誘導物。Elafin為特異性蛋白酶抑製劑、低分子量陽離子肽和在黏膜部位出現的特性，使之具有直接的抗微生物活性［6］，國外研究表明其在體外能積極抗革蘭陰性、革蘭陽性細菌、真菌、病毒等病原微生物。雖然Pa對elafin有一定的破壞作用，但適當濃度的Pa可使氣道局部elafin的總水平增加，使elafin與Pa處在高水平的動態平衡，殺滅部分Pa導致細菌數量減少。本研究結果顯示，轉染elafin後的A549細胞在含有銅綠假單胞菌的細菌培養基中孵育後，隨著細胞上清液中elafin水平的增加，細菌數量顯著減少，兩者呈現出一定的負相關。這與國外的研究顯示elafin能積極地抑殺體內細菌性病原體Pa［7］一致。Elafin的這種體內天然的抗蛋白酶抑製劑以及其獨特的抗菌特性和與Pa的相互作用的關係，顯示了它與人工合成抗生素在治療慢性肺部感染性疾病(尤其是銅綠假單胞菌感染)的優越性。
作者：聶曉紅 周向東 黃長武 《中國抗生素雜誌》
【參考文獻】
［1］ Kobayashi H. Airway biofilm disease［J］. Int J Antimicrob Agents,2001,17(5):351
［2］ 楊捷，周向東. 天然內生多肽elafin真核表達載體的構建及其在真核細胞的表達［J］. 中國抗生素雜誌，2005，30(10)：608
［3］ Costerton J W, Stewart P S, Greenberg E P, et al. Bacterial biofilms: a common cause of persistent infections ［J］. Science,1999,284(5418):1318
［4］ Pfundt R, van Ruissen F, van Vlijmen-Willems I M, et al. Constitutive and inducible expression of SKALP/elafin provides anti-elastase defense in human epithelia ［J］. J Clin Invest,1996,98(6):1389
［5］ Meyer-Hoffert U, Wichmann N, Schwichtenberg L, et al. Supernatants of Pseudomonas aeruginosa induce the Pseudomonas-specific antibiotic elafin in human keratinocytes ［J］. Exp Dermatol,2003,12(4):418
［6］ Sallenave J M. Antimicrobial activity of antiproteinases［J］. Biochem Soc Trans,2002,30(2):111
［7］ Simpson A J, Maxwell A I, Govan J R, et al. Elafin (elastase-specific inhibitor) has anti-microbial activity against Gram-positive and Gram-negative respiratory pathogens ［J］. FEBS Lett,1999,452(3):309
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