18株銅綠假單胞菌的耐藥譜和ERIC-PCR分型

【摘要】  目的 研究產金屬β-內酰胺酶(MBL)的銅綠假單胞菌感染的菌株同源性和耐藥譜。方法 用紙片協同法篩選出產MBL銅綠假單胞菌株；瓊脂擴散法檢測MBL陽性株對10種抗菌藥物的藥敏結果；用腸杆菌科基因間重複一致序列為引物的聚合酶鏈反應(ERIC-PCR)方法確定菌株之間的同源性。結果 紙片協同法試驗檢測到18株MBL陽性菌株，它們對頭孢噻肟、頭孢曲鬆、替卡西林/克拉維酸、頭孢呱酮/舒巴坦和頭孢他啶完全耐藥，對10種抗菌藥物呈現7種耐藥模式；ERIC-PCR結果顯示，18株MBL陽性株呈現4種基因型，15株為同一基因型。結論該院ICU內產MBL銅綠假單胞菌在2005年第二季度出現暴發流行。

【關鍵詞】  銅綠假單胞菌； 聚合酶鏈反應； 基因間重複一致序列引物； 金屬β-內酰胺酶； 耐藥譜

    ABSTRACT  Objective  To study the homology and resistant pattern of metallo-β-lactomase (MBL) producing Pseudomonas aeruginosa.  Method  Disk diffusion test was used to screen MBL producing isolates from Pseudomonas aeruginosa strains, and antibiotic susceptibility were detected by KB test. The homology among different strains was tested by enterobacterial repetitive intergenic consensus-PCR (ERIC-PCR) method.  Results  Eighteen strains of Pseudomonas aeruginosa producing MBL were isolated from patients in ICU. Antibiotic susceptibility data showed that all 18 strains were resistant to cefotaxime，ceftriaxone, ticarcillin/clavulanic acid, cefoperazone/sulbactam and ceftazidime, and there were seven drug-resistant profiles according to the susceptibility results of 10 antimicrobial agents. Results of ERIC-PCR genotyping showed that there were four PCR patterns, and 15 strains were in the same pattern.  Conclusions  The MBL producing strains in Pseudomonas aeruginosa appeared an outbreak in ICU in 2005.

    KEY WORDS  Pseudomonas aeruginosa;  ERIC-PCR;  Resistant spectrum;  Metallo-β-lactamase

    銅綠假單胞菌感染主要見於醫院感染人群，尤其是重症監護病房(ICU)中的重症患者，是目前各種感染中最廣泛、最嚴重的問題之一。隨著能夠水解碳青黴烯類抗生素的金屬β-內酰胺酶(MBL)的產生，對碳青黴烯類抗生素及三代頭孢菌素耐藥銅綠假單胞菌的分離率日漸增多，給臨床抗菌治療已帶來極大的困難。2005年4月至2005年6月，廣州某三甲醫院ICU從不同患者深部痰中持續分離出多重耐藥的銅綠假單胞菌，其耐藥譜基本相似，為明確這些分離株之間是否密切相關，采用ERIC-PCR分析同源性，並調查是否攜帶有金屬β-內酰胺酶。

    1.1  菌株來源

    2005年4月至2005年6月從廣州某三甲醫院ICU患者深部痰中分離的銅綠假單胞菌23株，試驗前重新鑒定。質控標準參考菌株：銅綠假單胞菌ATCC27853，來自美國菌種收藏中心。

    1.2  MBL鑒定試驗    采用文獻［1］報道的紙片協同法確認產MBL銅綠假單胞菌，挑取少量細菌稀釋在生理鹽水中，使濃度為1.5×108CFU/ml，將菌液均勻塗抹於MH平板上，MH平板上一側貼濾紙片，並加10μl EDTA(100mmol/L)，濾紙兩邊1.5cm處分別貼30μg頭孢他啶(CAZ)和10μg亞胺培南(IPM)藥敏紙片，在平板另一側貼上述3種紙片做對照，將MH平板置37℃孵箱過夜，EDTA濾紙和臨近的CAZ或IPM紙片之間出現明顯的抑菌環擴大現象，判斷為MBL陽性。

    1.3  產MBL銅綠假單胞菌的藥敏試驗

    選用的抗生素藥敏紙片有：頭孢噻肟(CTX)、頭孢曲鬆(CRO)、替卡西林/克拉維酸(TIPC/CA)、呱拉西林/三唑巴坦(PIPC/TB)、頭孢他啶(CAZ)、環丙沙星(CPLX)、頭孢呱酮/舒巴坦(CPZ/SB)、頭孢吡肟(CPE)、亞胺培南(IPM)、阿米卡星(AMK)。根據2005年CLSI標準判定。

    1.4  ERIC-PCR檢測菌株的基因型

    基因組DNA的抽提［2，3］：取200μl過夜培養的銅綠假單胞菌離心，沉澱加入200μl的無菌水，渦旋混勻，100℃煮沸8min，室溫離心8000r/min×10min，棄沉澱，上清液為模板，-20℃保存。PCR擴增：ERIC-PCR擴增引物(ERIC2)［4］：5′-AAGTAAGTGAC-TGGGGTGAGCG-3′。使用梯度PCR儀(德國Eppendorf公司)。PCR體積為50μl，含10×PCR緩衝液5μl，200μmol/L dNTP，1.5mmol/L MgCl2，1μmol/L引物，0.02U/μl Ex Taq酶，2μl DNA模板。反應條件：94℃預變性4min，然後94℃ 60s，57℃ 60s，72℃ 90s，共循環35次，最後72℃延伸10min。取PCR產物5μl在1.8%瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠染色成像。

    1.5  同源性判定標準

    應用BioNumerics 4.61軟件對圖像進行分析［5，6］，聚類圖類型，選擇UPGMA(unweighted pair group method using arithmetic averages)方法，條帶位置差異容許度選擇1.7%，優化值選擇0.5%，凡相似度的值大於80%者為同一亞型，代表同一克隆株，小於80%者為不同的基因型，代表不同的克隆株，分別依次命名為A、B、C和D型。

    2.1  產MBL菌篩選

    23株銅綠假單胞菌中有18株產MBL。MBL陽性菌株的結果表現為EDTA的紙片和臨近的CAZ或IPM紙片之間出現明顯的抑菌環擴大現象；MBL陰性菌株則表現為EDTA紙片和臨近的CAZ或IPM紙片之間無抑菌環或無明顯的抑菌環擴大現象。

    2.2  藥敏試驗結果

    18株菌對頭孢噻肟、頭孢曲鬆、替卡西林/克拉維酸、頭孢呱酮/舒巴坦和頭孢他啶完全耐藥，對環丙沙星、呱拉西林/三唑巴坦、頭孢吡肟、亞胺培南和阿米卡星5種抗菌藥物的耐藥率在83.3%～94.4%之間。18株MBL陽性株對10種抗菌藥物表現出7種耐藥模式，分別描述為a、b、c、d、e、f和g型(Tab.1)。

    2.3  ERIC-PCR結果

    由Fig.1可見，PCR產物多呈現為7～10條帶，主帶為5～7條，範圍從100bp～2000bp不等，相似度在80%以上的菌株認為是相同的菌株，相似度低於80%時，可認為流行病學不相關，18株銅綠假單胞菌表現為4種基因型，分別描述為A、B、C和D型，以A型最多，有15株。

    2.4  細菌耐藥模式和基因型之間的關係

    從Tab.1可見，18株MBL陽性株中，有15株為同一基因型，且A型在4～6月份內均有檢出，患者都有機械輔助通氣史，在細菌耐藥模式上，11株菌表現為完全耐藥，7株菌表現為多重耐藥，其藥敏差別主要體現在對呱拉西林/三唑巴坦、阿米卡星或亞胺培南3種抗生素上，其餘3株MBL均為獨立、單一的基因型。由耐藥模式看，11株a型均為同一克隆株，對所有10種抗菌藥物全部耐藥，其餘7株菌則表現為獨立的耐藥模式，其中c、d、e和f這4種耐藥模式亦來自該克隆株，隻是對呱拉西林/三唑巴坦、阿米卡星和亞胺培南3種抗生素的敏感度稍有不同。

    2005年4月至2005年6月，該ICU患者深部痰持續分離出多重耐藥的銅綠假單胞菌，並且發現其對青黴素類、頭孢菌素類和碳青黴烯類等種抗生素幾乎完全耐藥，少數僅對環丙沙星和阿米卡星敏感或中介。進一步研究顯示，這些菌株產MBL菌的分離率高達83.3%。為了解該ICU是否有銅綠假單胞菌的暴發流行，進行了分子流行病學的調查。本研究采用ERIC-PCR的結果表明，18株來自ICU的MBL陽性株表現為4種基因型，有15株為同一基因型，且在4～6月份內均有檢出，表明該院ICU產MBL銅綠假單胞菌感染在2005年第二季度出現暴發流行。據有關文獻報道［7～9］，希臘、韓國、巴西等國家的醫院均出現過產MBL銅綠假單胞菌的大暴發流行；國內亦有關於耐亞胺培南銅綠假單胞菌引起的院內感染的報道［10］。克隆株能在該ICU內持續流行，可能通過以下途徑：①呼吸機途徑。本次調查的患者在采集標本前均有機械輔助通氣48h以上，據報道［11］，機械通氣後細菌感染大多數為條件致病菌，主要為假單胞菌(占37.5%)，這是由於氣管插管及氣管切開破壞了氣道粘膜的正常保護作用，增加了感染的風險；②運用纖維支氣管鏡檢查、吸痰導致院內傳播，據Kirschke等［12］報道，由於纖維支氣管鏡設計、製造上的缺陷使得消毒不徹底導致銅綠假單胞菌的院內感染，使銅綠假單胞菌的分離率增高至47%，且經PFGE鑒定均為同一克隆株；③醫務人員手的清潔與消毒。文獻［13］報道，醫務人員在為患者做各種治療護理操作後，如未注意，直接觸碰另一患者，則細菌可通過手部傳播給另一患者，導致同一克隆菌株在院內播散。總之，由於ICU患者病情重，多有免疫功能低下，對病原菌的抵抗力較低，易合並機會致病菌的感染，因此進一步加強對產MBL感染菌株基因型的監測十分必要。

    本研究中18株MBL陽性株對10種抗菌藥物表現出7種耐藥模式，不但同一種耐藥模式可表現為不同的基因型，而且不同耐藥模式可有相同的基因型，表明細菌耐藥模式和基因型之間也無明確相關性，因此要通過耐藥模式來對細菌進行流行病學分型的方法並不可行。本調查中，11株耐藥模式為a型的菌株來自同一克隆株，因此，在臨床的檢測中，如發現同一時期大多數菌株出現同一耐藥模式，特別是多重耐藥菌株，應高度警惕該菌株是否有暴發流行，進一步作分子流行病學的調查。

    檢測MBL的方法有MBL-E試條、紙片協同法、PCR等，分別在基因和蛋白表達的水平上進行檢測。由於銅綠假單胞菌對亞胺培南的耐藥機製較多［14］，故僅選用亞胺培南做紙片協同法檢測MBL時可能出現假陰性的結果。另據Shibata等［15］報道，當產MBL菌株可產大量的ESBL、AmpC或CMY酶，又伴有膜的改變時，CAZ紙片周圍亦可不出現明顯的生長抑製帶，因此同時使用CAZ和IPM紙片可使陽性率明顯增高。本文中23株菌除了用紙片協同法檢測MBL，同時也用PCR法驗證，均獲得相同結果(該內容將另文發表)。由於紙片協同法檢測MBL成本低，方法簡單、快捷，因此適合在普通實驗室開展和臨床對產MBL菌的篩選、檢測。

檢測細菌基因型的方法較多，包括PFGE、RAPD、REP、ERIC和RFLP等，均為基於PCR和核酸電泳技術的分型方法。Liu等［16］用ERIC-PCR和PFGE兩種方法對比檢測23株臨床分離的洋蔥伯克霍爾德菌基因型，發現ERIC-PCR的重複性和區分能力同PFGE非常相近，但ERIC-PCR操作更簡便。本實驗通過預實驗優化PCR條件，采用57℃的退火溫度，擴增出分辨性好的5～7條帶也達到實驗目的，總之ERIC-PCR方法具有操作簡單、成本低、分辨效果好、可重複性好等優點，適用於細菌基因型的辨別，便於臨床進行分子流行病學監測。

 

  作者：伍曉鋒 黎毅敏 卓超 袁錦屏 楊靈 任筱《中國抗生素雜誌》

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