誌賀菌外排泵基因emrE的克隆表達及進化分析

【摘要】  目的 研究誌賀菌外排泵基因emrE的耐藥功能及其進化。方法以誌賀菌臨床多重耐藥株H24基因組為模板，擴增出含emrE基因的1126bp DNA片段，將所得片段與pMD18-T載體連接，轉化大腸埃希菌DH5α，對陽性克隆酶切鑒定和測序；用瓊脂平皿二倍稀釋法對重組菌株進行藥敏測定並測定泵抑製劑CCCP對MIC值的影響；通過RT-PCR從mRNA水平檢測emrE的表達水平；通過Genbank數據庫對基因序列進行同源性比對，建立進化樹並分析同源基因之間的關係。結果含emrE基因質粒可以提高大腸埃希菌對四環素耐藥性1倍，對紅黴素的耐藥性1倍；對emrE基因的同源分析顯示H24菌株和大腸埃希菌、其它誌賀菌可歸為相近一族，同源性在92%以上，與同屬於腸杆菌科的歐文杆菌和沙門菌的同源性分別為70%和60%；與親緣關係較遠革蘭陽性菌除蟲鏈黴菌和結核分枝杆菌的同源性僅為47%和48%。結論 誌賀菌耐藥株H24的emrE基因與對四環素及紅黴素的耐藥性相關，依據現有數據進行的emrE基因同源分析未發現有明顯的基因水平轉移現象。

【關鍵詞】  誌賀菌； emrE基因； 外排泵；耐藥； 基因水平轉移

    ABSTRACT  Objective  To study the function and phylogenetics of the active efflux pump gene emrE in clinical isolates of Shigella.  Methods  The active efflux pump gene emrE was amplified by PCR and ligated with the pMD18-T plasmid to construct the recombinant pMD-emrE, and the pMD-emrE was transformed into E.coli DH5α. The positive bacterial clones were identified by restriction enzyme digestion, and the gene of isolates was sequenced and analyzed. Drug susceptibility of the recombinant strain was tested by the two fold agar dilution method; phylogenic tree was constructed with the data of the gene sequences from Genbank.  Results Plasmid pMD-emrE can elevate the resistance level of E.coli to tetracyclin by one fold and erythromycin by one fold. Analysis of emrE phylogenic tree indicated that strain H24, all strains of E.coli and all other strains of Shigella could be classified into one group with 92% gene sequence identity. Strains of Erwinia and Salmonella, which also beloned to Enterobacteriaceae, had 70% and 60% sequence identity with H24. Streptomyces avermitilis and Mycobacterium tuberculosis were only 47% and 48% sequence identity with H24.  Conclusions  The gene emrE was related to the resistance of tetracycline and erythromycin in the drug resistance strain H24. Phylogenic tree analysis indicates it was scarce for emrE to develop horizontal gene transferring among different bacterial genomes.

    KEY WORDS  Shigella;emrE;Active efflux pump;Antibiotic resistance;Horizontal gene transfer

    誌賀菌屬(Shigella)細菌是急性感染性腹瀉的主要病原體之一。全世界每年由誌賀菌引起的感染病例數超過2億，約占腹瀉病例的15%以上［1］。我國以福氏和宋氏誌賀菌引起的痢疾最為常見。臨床上誌賀菌對抗生素和其它化學藥物的耐藥性日趨嚴重，如對目前臨床廣泛使用的喹喏酮類藥物的耐藥率已達40%以上，嚴重影響了臨床治療效果［2］。鑒於誌賀菌對人類的嚴重危害性，研究誌賀菌多重耐藥機製，調查這些基因的特性及分布進化，對臨床病原菌多重耐藥性的治療具有重要意義。

    主動藥物外排(active drug efflux)或稱外排泵係統(efflux pump system)耐藥機製的研究始於20世紀80年代關於大腸埃希菌對四環素耐藥機製的研究［3］。目前已發現主動外排泵係統廣泛存在於革蘭陰性細菌和革蘭陽性細菌中，它們在細菌的多重耐藥中發揮著重要作用［4～6］。1998年，Ghosh等發現誌賀菌中存在著主動外排機製［7］，國內楊海燕等證實了誌賀菌內也存在著Acrab-Tolc泵，它在喹諾酮類藥物耐藥中起重要作用［8］，但目前為止尚缺少對其它誌賀菌外排泵引起耐藥性的深入研究。

    H24是本實驗室保存的從鄭州市和江西省銅鼓縣采集的臨床致病誌賀菌中篩選出的具有很強的多重耐藥菌株之一［9］，現已克隆了該菌株多個多重耐藥主動外排泵基因。期望通過這些基因的耐藥特性研究和用這些耐藥基因建立藥物篩選模型，發現有針對性的抗菌藥物，如耐藥主動外排泵抑製劑等。

    外排泵基因emrE屬於小多重耐藥性家族(SMR)。SMR耐藥泵家族是已知細菌中最小的多重耐藥外排泵。通常由100多個氨基酸組成，形成四個跨膜螺旋。前3個跨膜螺旋為雙親性，含有許多保守的穀氨酸、絲氨酸、酪氨酸及色氨酸殘基，這些殘基的側鏈與底物的疏水區域直接作用而介導它們的跨膜轉運。SMR轉運蛋白為PMF能量來源型(第二類主動外排係統)［10］。SMR家族成員均來自於細菌，其中最典型的是大腸埃希菌的EmrE泵。通過對大腸埃希菌的EmrE泵研究發現SMR耐藥泵是通過多聚體的形式發揮功能的，形成同源三聚體［11，12］或四聚體［13］。目前已在多種菌株中發現emrE外排泵基因的分布，但其序列有較大差異，其進化意義和生理意義尚不十分明了。大腸埃希菌中emrE編碼的外排泵蛋白能引起對甲基紫精、四苯溴化磷、溴化乙啶、吖啶黃、結晶紫及紅黴素、四環素和磺胺嘧啶等的耐藥性［14，15］。本文報道克隆了包括調控序列在內的完整誌賀菌emrE耐藥泵基因，並在大腸埃希菌中測定了它的耐藥特性，同時初步分析了該基因在細菌中的分布和進化關係，為近一步進行耐藥性研究奠定了基礎。

    1  材料與方法

    1.1  材料

    (1)菌種及質粒  大腸埃希菌DH5α及臨床分離誌賀菌多重耐藥株H24由鄭州大學公共衛生學院流行病教研室收集保存；大腸埃希菌藥敏質控株ATCC25922由河南省疾病預防控製中心惠贈；pMD18-T載體購自大連TaKaRa公司。pMD18-T載體由pUC18改建而成，在pUC18載體的多克隆位點處的XbaI和SalI識別位點之間插入了EcoRV識別位點，用EcoRV進行酶切後，再在兩側的3′端添加“T”而成。它易於與PCR產物聯接並與pUC18具有相同的功能，選擇標記為氨苄西林抗性基因，通常用作克隆載體，但也能適度表達。

    (2)工具酶及試劑  SacI內切酶、BamHI內切酶、胰RNA酶、DNA回收試劑盒均為TaKaRa公司產品；抗生素購自中國藥品生物製品檢定所；酵母提取物和蛋白腖為Oxiod公司產品。泵抑製劑氰氯苯腙(CCCP)為Sigma公司產品。MH培養基為北京奧博星公司產品。Trizol RNA提取試劑盒，AMV反轉錄酶試劑盒購自上海生工生物工程有限公司。

    1.2  誌賀菌臨床株多重耐藥株的篩選

    在MH培養基上用瓊脂平皿二倍稀釋法測定臨床收集的30株誌賀菌耐藥株對四環素、氯黴素、紅黴素、慶大黴素、環丙沙星、磺胺和硫酸鏈黴素的最低抑菌濃度(MIC)。標準質控菌為ATCC25922。

    1.3  誌賀菌基因組DNA的提取

    按常規方法進行［16］。

    1.4  誌賀菌臨床株多重耐藥株emrE基因片段的獲取

    (1)基因擴增  從GenBank中查到誌賀菌emrE基因序列，利用Primer 5.0設計引物。引物設計的位點包含有emrE基因的調控序列，同時使其自身的啟動子與pMD-T載體的lac啟動子在同一方向上但與lac啟動子相隔約300bp，以期用自身的啟動子表達［15］。上遊引物P1為CGGGAGCTCAGCCTCAG-TTTCTATG，下遊引物P2為GCGGATCCAACAG-TCCAGTGCC。引物由北京賽百盛公司合成。以誌賀菌臨床多重耐藥株H24為模板，以P1和P2為引物進行PCR擴增。PCR條件為：95℃ 5min，94℃ 40s，58℃ 45s，72℃ 90s，30個循環，72℃延伸10min。對PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，膠濃度為1%。

    (2)目的片段的回收  PCR產物計50μl，1%瓊脂糖凝膠電泳後，用TaKaRa公司的DNA快速回收試劑盒回收，方法參考產品說明書。

    1.5  pMD-emrE重組質粒的構建

    PCR擴增片段經1%瓊脂糖凝膠電泳後用TaKaRa公司片段回收試劑盒回收目的片段，再與pMD18-T載體在16℃連接過夜。用連接產物轉化大腸埃希菌DH5α，塗布於含60μg/ml Amp的LB瓊脂平板上，37℃培養過夜後，利用藍白斑篩選挑取少許白色單克隆，在含Amp的LB液體培養基中培養過夜。堿裂解法從菌液中提取質粒，用SacI單酶切及SacI和BamHI雙酶切進行鑒定。

    1.6  pMD-emrE重組菌株耐藥性測定及CCCP對其耐藥性的影響

    以轉入pMD18-T空質粒的DH5α菌為對照，采用瓊脂平皿二倍稀釋法測定上述7種抗生素對篩選出的pMD-emrE重組菌株的MIC。同時在另一組含抗生素的MH瓊脂平板中加入CCCP至20μmol/L測定細菌的MIC值。

    1.7  RT-PCR檢測pMD-emrE重組菌株及pMD18-T空白對照株emrE基因的表達水平

    利用Trizol RNA提取試劑盒提取pMD-emrE重組菌株的總RNA，並用AMV反轉錄試劑盒進行反轉錄，得到2株菌的cDNA，利用Primer 5.0設計引物P3(GGGTTTACACGGTTATGGC)和P4(CTATGATGGCTGGCAGGTC)，擴增emrE基因內部的190bp DNA片段；引物P5(CTGGTCCGTCTAAA-GACAACA)、P6(ACGAACGGTCAGGTCAACTA)擴增大腸埃希菌內穩定表達的看家基因-編碼甘油醛3-磷酸脫氫酶的gapA基因的380bp片段作為內參。分別以2株菌的cDNA為模板，同一反應管中同時擴增emrE基因片段及甘油醛3-磷酸脫氫酶gapA基因片段。每個菌株測3次，每次都采用相同的反應條件。循環擴增條件：94℃ 5min，94℃ 40s，52℃ 45s，72℃ 90s，72℃延伸10min。擴增產物經瓊脂糖電泳後進行凝膠掃描半定量分析。

    1.8  序列測定及分子進化研究

    取酶切鑒定正確的重組質粒進行純化並由上海生物工程有限公司測序。測序結果利用DNAStar軟件分析找出emrE基因的編碼框，用BLASTn在Genbank中搜索同源序列，分析其結果。用在Genbank搜索出已報道的emrE的編碼序列，經MEGA3進行序列比對並構建分子進化樹。

2  結果

    2.1  耐藥株的篩選

    利用瓊脂平皿二倍稀釋法篩選出的臨床誌賀菌多重耐藥株H24對7種抗生素均呈不同程度的耐藥性，結果見表1。結果顯示該菌對四環素、紅黴素、氯黴素和硫酸鏈黴素MIC值都在64μg/ml以上，呈高度耐藥；對環丙沙星、慶大黴素等抗生素耐藥程度則較輕。

    2.2  emrE基因的PCR擴增

    用所合成的一對引物PCR擴增福氏誌賀菌H24的emrE基因，擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析，在約1126bp處有一特異擴增條帶，分子量大小與預期擴增值相符(圖1)。

    2.3  pMD-emrE重組質粒的鑒定

    用SacI單酶切和SacI和BamHI雙酶切對所提質粒進行鑒定，經1%瓊脂糖凝膠電泳後，確認得到了含目標基因的重組質粒(圖2)。

    2.4  重組大腸埃希菌菌株的耐藥性檢測及CCCP對其耐藥性的影響

    重組大腸埃希菌菌株的MIC如表2所示，結果表明攜帶有重組pMD-emrE質粒的菌株與攜帶空質粒的菌株相比耐藥性有所增強。對紅黴素和四環素的MIC均為對照株的2倍，顯示該基因有增強細菌耐藥性的作用。加入CCCP後，2株菌對不同抗生素的MIC值均有不同程度的下降，並且下降到了同一水平，顯示耐藥性對跨膜質子梯度的依賴性(表2)。表1      誌賀菌多重耐藥株H24的MIC(μg/ml)（略表2    重組菌株pMD-emrE的MIC(μg/ml)（略 ）

    2.5  RT-PCR結果

    對pMD-emrE重組菌株及帶有空質粒的對照株用RT-PCR檢測emrE基因的mRNA相對表達水平。emrE擴增片段的亮度以gapA片段為100%對照。三次凝膠掃描半定量檢測結果顯示pMD-emrE重組菌株emrE表達量增強，相對強度為對照的5.27倍。結果經t測驗，差異極顯著(P<0.01，圖3和表3)。

    2.6  測序結果的序列分析及分子進化樹的構建

    誌賀菌臨床耐藥株H24 emrE基因測序結果經BLASTn與Genbank中的宋氏誌賀菌株S.sonnei Ss046的emrE基因堿基序列比較分析，兩者完全一 表3    pMD-emrE重組菌株emrE表達量的RT-PCR（略 ）致；與福氏誌賀菌2a 301株、福氏誌賀菌5及福氏誌賀菌2a 477株、大腸埃希菌CFT01株和536等菌株的DNA序列一致性為98%，肽鏈的一致性為100%；與大腸埃希菌0157∶H7和K12等菌株的DNA序列一致性為92%，肽鏈的一致性為98%。在這些基因序列的變化中，多為同義突變，顯示emrE耐藥泵基因的保守性，結果見表4。

    利用在Genbank中檢索到的不同菌株的emrE基因序列構建的分子進化樹如圖4所示。誌賀菌和大腸埃希菌聚集為一族。該族可分為三個亞群：宋氏誌賀菌為第一亞群；福氏誌賀菌和大腸埃希菌536等為第二亞群；大腸埃希菌K-12和0157為第三亞群。在該族菌株中未發現含有與其它種屬非常相近的emrE基因序列，也未在其它種屬菌株中發現與誌賀菌和大腸埃希菌族非常相近的emrE基因序列。顯示了該基因的種屬特征性和穩定性。對於其它菌株也表現出在進化分類上距離愈遠，進化樹上距離也愈遠的規律，有較好相關性。

    3  討論

    本研究克隆出誌賀菌臨床耐藥株H24包括調控序列在內的emrE基因並連接到pMD18-T質粒上，該質粒為高拷貝質粒，emrE帶有自身的調控序列，可在自身的啟動子調控下進行表達。通過測定重組菌株的MIC，發現攜帶有emrE基因的重組菌株與未攜帶該基因的菌株相比對四環素和紅黴素的MIC值均提高了1倍，而對其它5種抗生素的MIC值則無變化。RT-PCR結果也證實了pMD-emrE重組菌emrE基因的表達水平比pMD18-T對照株有顯著提高。由此可見H24菌株emrE基因在大腸埃希菌中得到了較高表4        誌賀菌和大腸埃希菌與H24菌株emrE基因的DNA和肽鏈序列差異（略 ）

    強度的表達。這與已報道的大腸埃希菌emrE基因的功能是相似的［17］。加入質子泵抑製劑CCCP後，重組株和對照株對四環素和紅黴素的耐藥性降低到同一水平，確認了emrE外排泵是質子泵。另外，加入CCCP後這兩株菌對7種抗生素的MIC值均有較大幅度的下降，說明在這兩株菌中還存在著其它以質子梯度為能量的外排泵。誌賀菌臨床耐藥株H24對四環素和紅黴素的MIC值都為128μg/ml，而該耐藥株的emrE基因在大腸埃希菌中表達量提高後僅使它們對四環素和紅黴素的耐藥性分別達到8和16μg/ml(大腸埃希菌受體菌對照的MIC值分別為4和8μg/ml)，說明誌賀菌臨床耐藥株H24對四環素和紅黴素的耐藥性可能還有其它的耐藥基因在發揮著作用。

    通過檢索發現，Genbank中200多種已經測出全基因組序列的微生物中共有20多種菌株有emrE基因，在此基礎上進行同源性分析並構建進化樹，發現宋氏誌賀菌與親緣關係很近的福氏誌賀菌及大腸埃希菌(基因組分析顯示誌賀菌是大腸埃希菌複合群的一類［17］)的emrE序列的同源性非常高，在92%以上；與同屬於腸杆菌科的歐文杆菌和沙門菌的同源性分別為70%和60%；而與親緣關係較遠革蘭陽性菌除蟲鏈黴菌和結核分枝杆菌的同源性僅為47%和48%。可見親緣關係較近菌株的emrE序列同源性非常高而親緣關係較遠的序列差異較大。目前尚未發現親緣關係較遠而emrE序列同源性較高的菌株，因此可以推測emrE基因所介導的耐藥是細菌在長期進化中形成的，現有資料未發現emrE基因在近代發生明顯的水平轉移現象。

    現代基因組學研究揭示微生物之間的基因水平轉移發生的頻率很高［18，19］，但為什麽emrE基因的種屬歸屬性這樣強？盡管臨床上四環素和紅黴素已應用多年，在生態環境中有很高的選擇壓力，但以上分析未發現emrE基因有明顯水平轉移。在其它耐藥泵基因的研究中，也有發現有類似的保守現象［8，20］。分析原因可能有兩點：第一，微生物在自然生態環境中麵臨著許多有害物質和其它生態壓力因素，有很多方麵的選擇壓力在起作用，抗生素僅是其中一種；第二，我們近期研究發現許多重耐藥外排泵不僅能泵出有害物質，也能泵出某些重要營養物質，這可能是耐藥泵快速進化(泵出能力的垂直進化和基因水平轉移進化)的一個重要製約因素。不同類群菌株的emrE基因可能隻適合於特定菌群的遺傳背景。關於不同微生物來源的emrE基因的功能差異和生理意義還待進一步研究。

 

  作者：吳健 張少平 穆瑞瑞 丁毅 郗園林 段廣才  《中國抗生素雜誌》

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