肺炎鏈球菌檢測方法及耐藥研究

肺炎鏈球菌（Streptococcus Pneumoniae, SP）是兒科社區獲得性感染的主要病原菌之一，它可引起兒童肺炎、腦膜炎、敗血症、中耳炎、鼻竇炎。據WHO統計，全球每年約有超過120萬人死於SP感染性疾病，其中大多數為2歲以下兒童［1］。早期有效的抗生素治療可大大降低病死率，因此在臨床工作中，應用快速、可靠的診斷技術檢測SP感染，及早使用有效抗生素治療顯得尤為重要。近年來SP分離株對青黴素、頭孢菌素、大環內酯類等多種抗菌藥物耐藥性在全球呈普遍上升趨勢，SP耐藥性的擴散及多重耐藥菌株的出現成為臨床上引起廣泛關注的問題。

　　1  SP檢測方法

　　1.1 細菌培養

    在臨床實踐中，對社區獲得性肺炎患者通過應用常規的檢測方法來確定病原菌仍存在許多障礙。從血液或胸腔積液培養分離獲得SP仍然作為診斷的金標準，但它的陽性率僅10%～30%，甚至更低［2］。SP可定植於健康人群的鼻咽部及不充足或不恰當的痰標本使得基於痰培養的診斷標準飽受爭議。此外，近1/3的患者進行病原學檢測前已接受了抗生素治療，這又降低了這種傳統的檢測手段的敏感性。若通過一些創傷性操作所獲得的標本（如支氣管灌洗液、肺穿刺獲得的肺組織等）培養分離得到SP，則對病原學的診斷具有決定性意義。但是，由於創傷性技術需要專業人員進行操作並且有發生並發症的可能，因此不作為常規檢查。雖然細菌培養所需要等待的時間較長（一般3～5 d），可能出現假陰性的結果（後者與標本量過少、已接受抗生素治療或不理想的實驗室條件均有關），但由於它是進行藥敏試驗及對流行株進行流行病學分析的基礎，因此該技術在臨床上仍有不可取代的地位。   

　　1.2 免疫層析法

    免疫層析法（ICT）是目前廣泛用於SP診斷的快速方法。其檢測的抗原為Cpolysaccharide抗原，是位於細菌細胞壁的C多糖，為SP各血清型所共有。由於ICT以尿樣為檢測對象，故又稱為尿抗原檢測法。

    目前世界各國采用的是美國緬因州波特蘭Binax公司生產的Binax NOWICT試劑盒。這是個非常簡便的方法，隻需15 min便可完成。該方法推薦使用的標本為標準的非濃縮尿樣。將拭子條浸入尿樣後置於檢測卡中，再加入6滴試劑，15 min後出現1條色帶的為陰性，2條色帶的為陽性結果［3］。該試劑盒在臨床診斷中具有較好的敏感性和特異性。據現有的報道敏感性為67%～92%（大多為75%～85%），特異性為90%～100%。該試劑盒同樣可用於檢測胸腔積液、腦脊液和支氣管灌洗液。2002～2006年，西班牙的Jose M. Porcel等人采用該試劑盒對患者的胸水進行檢測，發現敏感性為70.6%，特異性為93.3%。該方法較突出的優點是抗生素的使用並不影響檢測結果的準確性，因此它不能用於評價抗生素治療效果。在感染後1月內該試驗均可陽性，這也造成了那些反複感染的病例被誤診的潛在可能性。特別在兒童中，由於SP的定植造成該試驗非特異性陽性的問題已逐漸引起了關注。盡管該試驗在SP感染的兒童中敏感性較高，但在尿抗原檢測呈陽性的病例中仍有7%～15%的病例沒有SP感染的臨床證據［4］。

    ICT雖然在SP鼻咽攜帶者中存在假陽性結果，但由於ICT標本采集簡便，不具創傷性，不受先前抗生素治療幹擾，具有較高的敏感性和特異性，15 min便可完成檢測等優點，是快速診斷SP感染的簡便方法。

　　1.3 聚合酶鏈式反應

    聚合酶鏈式反應（PCR）敏感性高，特異性強，實時熒光定量PCR可對擴增產物進行可重複定量檢測，在擴增的每個循環中至少收集一次熒光數據，對擴增產物進行實時監控，從而增加PCR的敏感性和特異性。2001～2004年，Alban Le Monnier等［5］對社區獲得性肺炎患者的胸腔積液進行SP16S rDNA基因檢測，發現該試驗的敏感性為77%。在抗生素治療初期，PCR不受其幹擾，因此為早期診斷提供了較可靠的依據。然而，與ICT相比，PCR是一種複雜、耗時的檢測方法，還未完全標準化，從而妨礙其成為SP臨床診斷方法，主要作為實驗研究的技術方法。

　　2  耐藥現狀及耐藥機製

　　2.1 β內酰胺類抗生素

    在上個世紀四、五十年代，當青黴素被應用於臨床初期，SP對青黴素是相當敏感的。當時大部分菌株的青黴素MIC 0.015～0.03 mg/L。上世紀60年代，在澳大利亞和新幾內亞，部分SP出現了對青黴素敏感性降低的現象，分離出對青黴素耐藥的SP（penicillinresistant streptococcus pneumoniae, PRSP）。70年代末，南非報道了對青黴素高水平耐藥的菌株，這些菌株的青黴素MIC高達2～4 mg/L。在美國，SP對青黴素的耐藥情況在70年代及80年代初沒有顯著的變化，持續保持在10%或更低。但在80年代末及整個90年代，SP對青黴素的耐藥性發生了戲劇性的變化，不敏感率顯著增加。有報道稱，在1993～2004年，耐藥菌株增加了近30倍。亞洲地區耐藥性病原監測網（ANSORP）的監測結果表明SP對青黴素的耐藥率為29.4%，不敏感率為52.4%［6］。2000～2002年兒童鼻咽部分離887株SP對青黴素耐藥率為6.4%，青黴素不敏感率39.9%［7］。   

　　2001年美國臨床實驗室國家標準委員會（National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS）判斷SP對青黴素耐藥的標準是：MIC≥2 mg/L為耐藥；MIC 0.12～1.0 mg/L為中度耐藥；≤0.06 mg/L為敏感。

    青黴素耐藥的產生是由於細胞壁上一種或多種青黴素結合蛋白（PBP）的改變，這種改變同樣可以影響到PBP與整個β內酰胺類抗生素的結合［8］。如果抗生素在感染部位有足夠濃度的話，這種耐藥機製即可被克服。在呼吸道感染的情況下，隻要給予適當劑量的藥物，大部分的SP對β內酰胺類抗生素，比如靜脈滴注頭孢曲鬆和口服阿莫西林仍然保持敏感。

　　2.2 大環內酯類和林可黴素類抗生素

    SP對大環內酯類藥物的耐藥率在近20～30年間迅速增長。Alexander Project［9］研究結果顯示，1998～2000年全球紅黴素耐藥率為24.6%。亞洲國家耐藥程度比歐美國家嚴重，ANSORP的監測結果表明，1998～2001年亞洲地區對大環內酯類抗生素耐藥的SP（macrolideresistant streptococcus pneumoniae, MRSP）占59.3%［10］。我國北京、上海、廣州三家兒童醫院上呼吸道感染患兒鼻咽部SP紅黴素耐藥率為84.3%［6］。

    SP對大環內酯類的藥敏試驗分為三種情況：敏感（MIC<1 mg/L）、低度耐藥（MIC 1～32 mg/L）和高度耐藥（MIC>64 mg/L）。低度耐藥和高度耐藥的臨床特點即對現有的所有大環內酯類藥物均出現耐藥，兩者不同之處在於前者對林可黴素通常敏感。兩者的耐藥機製也有所不同：低度耐藥常常由mefA基因介導，耐藥表型為M型（即對大環內酯類耐藥而對林可黴素類敏感）；高度耐藥常常由ermB基因介導，耐藥表型為MLSB型（即對大環內酯類、林可黴素類和鏈陽黴素B類均耐藥）。M型的耐藥機製為泵出機製，即將細胞內的大環內酯類藥物移至細胞外；MLSB型的耐藥機製為核糖體靶位修飾機製，主要由SP產生甲基酶使核糖體亞基中的腺嘌呤發生雙甲基化，從而阻止大環內酯類、林可黴素、鏈陽黴素B等抗生素與之結合。美國在2000～2004年對MRSP菌株的觀察性研究中發現，在11 576株菌株中，M表型占主導地位（65.7%），而MLSB表型在研究過程中由初期的9.7%上升至18.4%［11］。而在全球的其它地區MLSB表型仍較為流行。

　2.3 喹諾酮類抗生素

    大部分SP對喹諾酮類藥物保持較高的敏感性，但近期南非報道了當地兩所結核病醫院，在用喹諾酮類藥物治療多重耐藥結核病的過程中，12例病例發生了對左氧氟沙星耐藥的SP的侵襲性感染［12］。

    喹諾酮類抗生素所攻擊的目標是DNA促旋酶和拓撲異構酶IV，它們對DNA超螺旋結構和細胞的增殖是至關重要的。SP對喹諾酮類的耐藥是由於染色體的促旋酶gyrA基因和（或）拓撲異構酶IVparC基因發生突變造成的。任何一個基因突變，往往表現對喹諾酮類呈低水平耐藥；而兩個基因均發生突變，則表現為高水平耐藥，即對喹諾酮類多種抗生素發生耐藥。

　　2.4 四環素類抗生素

    SP對四環素類抗生素的耐藥是通過tet介導的核糖體蛋白形成的，而tet基因往往攜帶接合性轉座子或質粒，造成了耐藥性在細菌間的擴散。tet基因在人類、動物及周圍環境中的多種細菌中被證實，而在SP中主要為tet (M), 偶爾可以發現tet (O)。該基因編碼胞質蛋白，從而保護細菌的核糖體免受四環素類抗生素的攻擊。由於tet (M)和erm (B)基因定植於同一染色體的接合性轉座子，因此對四環素類的耐藥性與對大環內酯類的耐藥性有一定的相關性［13］。據近期美國報道的對2000～2004年近40 000株SP的觀察性研究發現，四環素類的耐藥率為14.6%～15.9%，並且該耐藥率有每年輕度下降的趨勢［11］。

　　3 結束語

由於耐藥SP感染大量增加，多重耐藥SP感染已成為全球麵臨的嚴峻挑戰。ICT是診斷SP感染快速、可靠的方法，並可以為治療贏得時間。因此，必須合理使用抗生素，加強耐藥監測，在耐藥株高度流行區域，對高危人群使用SP多價結合疫苗以及開發新型抗生素是解決SP耐藥的有效措施。

 作者：俞蕙《兒科藥學雜誌》

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