【摘要】 目的 研究產超廣譜β內酰胺酶(ESBLs)菌株整合子分布以及在ESBLs基因水平轉移中的作用。方法 采用PCR方法檢測產ESBLs和非產ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的整合酶基因,分析整合子在產TEM、CTX和SHV型ESBLs菌株中的分布及經質粒轉移的情況。結果 產ESBLs菌株中blaTEM、blaCTX 和blaSHV基因檢出率分別為58.2%、74.7%和32. 9%；產ESBLs菌同時具有≥1種的ESBLs基因, bla SHV+ CTX基因檢出率為12.9%、blaCTX+TEM為9.8%、 blaSHV +TEM為8.7% 和 blaSHV+ CTX+ TEM為5.2%。結論產ESBLs菌株中blaTEM、blaCTX 和blaSHV基因與整合子具明顯相關性；整合子攜帶著1個以上的多個耐藥基因盒,與宿主菌的多重耐藥性密切相關。
【關鍵詞】 耐藥基因 超廣譜β內酰胺酶整合子
【Abstract】 Objective To study the distribution of class Ⅰintegron in extended-spectrum beta-lactamases (ESBLs)-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae and its contribution in horizontal transfer of ESBLs genes.Methods The presence of class Ⅰintegron among ESBLs-producers and non-ESBLs-producers of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae were detected by polymer asechain reaction(PCR).The correlation and co-transfer between integron and genes coding for SHV, CTX and TEM were studied.Results The positive rate of blaTEM、blaCTX and blaSHV was 58.2%、74.7%、32. 9% respectively; bla SHV+ CTX、blaCTX+ TEM、 blaSHV +TEM and blaSHV+ CTX+ TEM was 12.9%、9.8%、8. 7%、5.2% respectively. Conclusion The positive rate of blaTEM、blaCTX and blaSHV was related with class Ⅰintegron;The integron with antibiotic resistance gene cassette contributes to multidrug resistance in ESBLs-producing strains.
【Key words】 antibiotic resistant gene; ESBLs; integron
ESBLs是導致革蘭陰性菌對β-內酰胺類抗菌藥物耐藥的重要機製。質粒、轉座子和整合子對耐藥基因在細菌間的水平轉移起著重要作用。整合子可特異性地俘獲和表達外源基因盒,並以質粒或轉座子為載體在細菌間移動,導致耐藥基因的快速和廣泛播散。整合子可攜帶對氨基糖苷類、喹諾酮類、磺胺等耐藥基因盒。整合子大致可分為Ⅳ類,其中Ⅰ類在捕獲和表達耐藥基因中最常見。因此本文通過研究產ESBLs菌株中Ⅰ類整合子的分布和性質,明確菌株的播散趨勢,有效監控細菌耐藥。由於肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌是臨床最常見的產ESBLs菌,其中CTX-M、SHV和TEM是最常見的ESBLs型別，本文對我院2006年肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌的臨床分離株,檢測Ⅰ類整合子在產TEM、CTX和SHV型ESBLs菌株中的分布,明確Ⅰ類整合子在產ESBLs肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌的流行和播散中的臨床意義。
1 材料與方法
1.1 菌株來源 281株肺炎克雷伯菌和201株大腸埃希菌均為我院臨床標本中分離並按全國統一操作規程［1］。標本主要包括血液、尿液、痰和其他分泌物。
1.2 儀器試劑 VITEK-2型全自動微生物分析儀、ID-GN 鑒定卡、AST-GN09藥敏卡由法國Bio-Merieux公司生產; VITEK 比濁計(V 1210) 由日本生產；PCR擴增儀為美國PERKIN ELMER公司9600型基因擴增儀；日本三洋MDF型超低溫冰箱;德國Hettich公司22R型低溫超速離心機;美國水套式恒溫培養箱。
1.3 菌種鑒定、藥敏 所有實驗菌株分離純化後按VITEK-2的使用要求配製成菌懸液和稀釋液, 分別填充到ID-GN和AST-GN09卡中, 用VITEK-2儀器自動完成細菌的鑒定和藥敏試驗。
1.4 質控菌株 由衛生部臨床檢驗中心提供的標準菌株大腸埃希菌(ATCC 25922)、銅綠假單胞菌(ATCC 27853) , 藥敏質控結果符合NCCLS 藥敏質控要求。
1．5 超廣譜β內酰胺酶（ESBLs）檢測 按照NCCLS 2000年版推薦的紙片擴散表型確證法進行檢測。用肺炎克雷伯菌 ATCC700603為陽性對照，大腸埃希菌 ATCC2592為陰性對照。
1.6 耐藥基因的檢測 采用堿裂解法和蛋白酶K法提取被測細菌的質粒和染色體基因,提取方法根據不同引物設立不同PCR條件；以ATCC700603肺炎克雷伯菌和TEM-26型大腸埃希菌分別作SHV型和TEM型陽性對照。
1．7 質粒接合轉移 將產ESBLs菌株和大腸埃希菌培養到對數生長期,按6：1（v/v）接種,
1.8 PCR耐藥菌基因［2］ 根據GenBank公布的Ⅰ類整合子整合酶基因和blaSHV、blaCTX和blaTEM基因序列，采用Primer軟件設計引物(表1)。反應體係均為25μl,其中緩衝液2.5μl,10mmol/L 4×dNTP 0.5μl,50μmol/上下遊引物各1μl,DNA多聚酶0.25μl,DNA模板1μl,超純水18.75μl 。根據不同引物設立不同PCR反應條件。以ATCC700603肺炎克雷伯菌作SHV型陽性對照，以TEM-26型大腸埃希菌作TEM型陽性對照,產物經電泳,在紫外線下觀察結果,並在凝膠上成像。
1.9 DNA序列分析［3］ PCR擴增的基因片段經電泳後,切下相應條帶純化,進行DNA測序,結果在GenBank序列數據庫進行同源性分析(BLASTN)。
1．10 統計學處理［2］ 細菌耐藥性分析用 WHONET5軟件進行分析，耐藥率差異有顯著性，用SPSS10.0統計軟件分析,兩組耐藥率比較應用χ2檢。表1 用於檢測耐藥基因的引物
2 結果與分析
2．1 ESBLs檢出結果及耐藥率 281株肺炎克雷伯菌和201株大腸埃希菌共檢出ESBLs 194株，占40.３%,非產ESBLs細菌為288株占59.7%。產ESBLs 的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對抗生素的平均耐藥率為74.1%,明顯較非產ESBLs株平均耐藥率47.9%高(P<0.05)。產ESBLs的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌除頭孢替坦外，對其他頭孢類抗生素的耐藥率均在90%以上；對β內酰胺和碳青黴烯類如氨苄西林、氨曲南和呱拉西林的耐藥率為100%，僅對美洛培南和亞胺培南二種抗生素未產生耐藥；產ESBLs的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對多種抗生素耐藥率明顯高於非產ESBLs菌株(P<0.05)(表2)。表2 產ESBLs和非產ESBLs菌對抗生素的耐藥率
2．2 產ESBLs菌株的PCR檢測 對13株產ESBLs菌株(其中8株大腸埃希菌和5株肺炎克雷伯菌)的PCR產物測序，其中blaTEM陽性的擴增產物為TEM-1基因, blaCTX陽性的擴增產物為CTX-M-3基因,而blaSHV陽性的擴增產物則分別為SHV-1、SHV-5、SHV-11和SHV-12。blaTEM、blaCTX和blaSHV基因的PCR瓊脂凝膠電泳如圖1～3。圖1 TEM基因PCR擴增電泳圖圖2 SHV基因PCR擴增電泳圖(1： DNA分子量標誌,2000bp梯帶；
2:陰性對照；3～5:臨床菌株。)
圖3 CTX基因PCR擴增電泳圖
2.3 blaTEM、blaCTX和blaSHV的基因檢測結果 產ESBLs菌株的blaTEM、blaCTX 和blaSHV基因檢出率分別為58.2%、74.7%和32. 9%，產ESBLs菌同時具有≥1種的ESBLs基因如bla SHV+ CTX、blaCTX+ TEM、 blaSHV +TEM 和 blaSHV+ CTX+ TEM基因檢出率分別為12.9%、9.8%、8.7%和5.2%。其中93株產ESBLs大腸埃希菌中, blaTEM基因檢出率為81.7% (76/93), blaCTX基因檢出率為94.6% (88/93), blaSHV基因檢出率14.0% (13/93)，blaSHV+ CTX基因檢出率12.9% (12/93)， bla CTX+ TEM基因檢出率8.6% (8/93)，blaSHV +TEM基因檢出率9.7% (9/93), blaSHV+ blaCTX+ blaTEM基因檢出率4.3% (4/93)。101株產ESBLs肺炎克雷伯菌中, blaTEM基因檢出率為36.7% (37/101), blaCTX基因檢出率為56.4% (57/101), blaSHV基因檢出率為50. 5% (51/101), blaSHV+ CTX基因檢出率12.9% (13/101)， bla CTX+ TEM基因檢出率10.9% (11/101)，blaSHV +TEM基因檢出率7.9% (8/101), blaSHV+ blaCTX+ blaTEM基因檢出率5.9 % (6/101)(表3)。
2．4 產ESBLs菌株陽性和陰性整合子對抗菌藥物的耐藥率 兩組對頭孢類抗生素如頭孢他啶和頭孢曲鬆的耐藥率均>90%，經χ2檢驗P>0.05差異無顯著性，而產ESBLs菌株陽性對頭孢噻肟和頭孢唑啉的耐藥率也均>90%，但與整合子陰性的產ESBLs菌株比較P<0.05，差異有顯著性。產ESBLs菌株陽性整合子對其他抗生素如氨苄西林和呱拉西林的耐藥率均高於整合子陰性產ESBLs菌株,經χ2檢驗,差異有顯著性(P<0.05)。兩組對亞胺培南和美洛培南的耐藥率均很低（表4）。表3 3種基因型PCR產物在產ESBLs菌株中的分布表4 產ESBLs菌株陽性和陰性整合子對抗菌藥物的耐藥率
3 討論
大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌為革蘭陰性杆菌，常寄殖於人體上呼吸道和腸道，是重要的條件致病菌和院內感染常見的病原體之一［4］。ESBLs主要在大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中發現。本文ESBLs從大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌的檢出率為40.3%。產ESBLs菌對常用抗生素的平均耐藥率高達74.0%,對氨苄西林、環丙沙星、一二三代頭孢菌素均具有很高的耐藥率，產生了明顯的多重耐藥［5］。
由於ESBLs是質粒介導，可通過轉化、轉導、接合轉移等方式傳遞而造成耐藥菌流行。質粒、轉座子和整合子對耐藥基因在細菌間的水平轉移起著重要作用［5，6］。本文用PCR檢測產ESBLs大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中Ⅰ類整合子的分布,結果顯示blaTEM陽性的壙增產物為TEM-1基因, blaCTX陽性的擴增產物為CTX -3基因,而blaSHV陽性的擴增產物則分別為SHV-1、SHV-5、SHV-11和SHV-12基因。blaTEM、blaCTX 和blaSHV基因檢出率分別為58.2%、74.7%和32. 9%，說明產ESBLs菌株中blaTEM、blaCTX 和blaSHV基因與整合子具明顯相關性，但三者經質粒與整合子共同轉移的頻率不同。其中blaCTX的轉移率最高,達到74.7%,其次為blaTEM（ 58.2%），blaSHV的轉移率最低。提示本文中產ESBLs臨床分離株中的blaCTX與整合子緊密相關。推測blaCTX可能位於整合子中或者與整合子位於同一個接合性質粒的遺傳元件上，可能是ESBLs菌株遺傳元件的主要流行方式。
本文71株產ESBLs菌同時具有≥1種的ESBLs基因,其中bla SHV+ CTX基因檢出率為12.9%、blaCTX+ TEM為9.8%、 blaSHV +TEM為8.7%和blaSHV+ CTX+ TEM為5.2%。說明整合子攜帶著1個以上的多個耐藥基因盒,與宿主菌的多重耐藥性密切相關。這可能揭示了本文中產ESBLs臨床分離株對頭孢類、β-內酰胺類和喹諾酮類抗生素多重耐藥的發生和轉移機製［7］。也是導致整合子陽性株對三代和四代頭孢菌素高耐藥率的重要原因。
作者：徐琳
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