培養條件對兩性黴素B抑製白色念珠菌作用的影響

【摘要】  目的 綜合考察各種因素（不同的培養基、培養基的pH值、真菌接種濃度等）對AmB抑製白色念珠菌作用的影響，為臨床合理用藥提供理論依據。方法 液體稀釋法。結果 在不同的培養基中，AmB對白色念珠菌的MIC值不同，隨著pH的增高及真菌接種菌液濃度增加，其MIC值增加。結論 AmB對白色念珠菌的MIC值會受到多種因素的影響，所以，進行藥物的抗菌活性研究時應製定並嚴格執行統一的標準。

【關鍵詞】  兩性黴素B；白色念珠菌；抑製

    【Abstract】  Objective  To investigate the effects of various factors, such as the type of medium, Ph of medium, size of inoculum on the activity of amphotericin B (AMB) against Candida albicans, so as to provide evidences for rational use of the drug. Methods  The broth dilution test was examined.Results  The activity of AmB against Candida albicans was influenced by the type of medium.The minimum inhibition concentrations (MIC) increased with the increase of pH and inoculum concentration. Conclusion  The study of antifungal activity must establish and strictly implement unified standard.

    【Key words】  amphotericin B; Candida albicans; inhibition

    藥物的抗真菌活性受到多種因素的影響，例如，不同的培養基、培養基的pH值、培養時間、培養溫度、真菌接種濃度、真菌形態、血清、有氧與厭氧環境等。兩性黴素B是目前臨床上應用的抗真菌藥物，本研究是綜合考察各種因素對其抑製白色念珠菌作用的影響，為臨床合理用藥及進一步藥用價值的開發奠定基礎。

    1.1  菌株  白色念珠菌Cla，購於中國醫學真菌保藏中心。

    1.2  藥品  兩性黴素B（amphotericin B,AmB），上海先鋒藥業公司，上海第二製藥廠生產。AmB溶於蒸餾水中製備成濃度為1280μg/ml的藥物原液，過濾除菌。臨用時用滅菌蒸餾水稀釋為128μg/ml最高濃度藥液。

    1.3  培養基  改良沙氏液體培養基（1%蛋白脈，4%葡萄糖）；YEPD培養基（2%蛋腖，2%葡萄糖，1%酵母浸粉）。

    1.4  其他  HZQ-X100A型恒溫振蕩培養箱（上海一恒科學儀器有限公司產品）；5000μl、1000μl加樣槍（法國GILSON產品）；SN-CS-2D單人淨化工作台（蘇州淨化設備廠）；改良沙堡氏液體培養基（北京奧博星生物技術責任有限公司）。血球計數板、顯微鏡、濾器（水質濾膜）等。

    2  實驗方法

    2.1  不同的培養基對MIC值的影響  取活化2次並處於對數生長期的白色念珠菌，用血球計數板計數菌濃度使約為105cfu/ml，以液體稀釋法［1］測定改良沙氏液體培養基和YEPD培養基對最低抑菌濃度的影響：（1）2～10管加1ml培養基；（2）1管加1ml藥液（128μg/ml），2管加1ml藥液（128μg/ml），然後用槍尖吹打混勻，吸取1ml到第3管，依次倍比稀釋至第8管後棄去；（3）取上述濃度為105cfu/ml的0.1ml菌液按9→1的順序加入上述9管中，28℃培養24h，不攪動情況下，以培養基清晰的試管為菌株100%受抑製，此管的藥物濃度即為最低抑菌濃度（MIC）。

    2.2  培養基pH值對MIC值的影響  用0.1mol/L甘氨酸-鹽酸緩衝液（pH 3～5）和磷酸鹽緩衝液（pH 6～8）調整沙氏培養基的pH分別為3、5和8，然後按上述方法測定MIC值。

    2.3  接種真菌濃度對MIC值的影響  將濃度為102cfu/ml，103cfu/ml，104cfu/ml，105cfu/ml，106cfu/ml的菌液接種於改良沙氏液體培養基，其餘步驟與上法同，測定其MIC值。

    3.1  不同的培養基對MIC值的影響  AmB在兩種培養基中的最低抑菌濃度不同，在改良沙氏液體培養基（pH 5～6）中的MIC為8μg/ml，在YEPD液體培養基（pH 5～6）中的MIC為16μg/ml。

    3.2  培養基pH對MIC值的影響  結果發現在沙氏培養基中，pH為3時其MIC值為32μg/ml，pH為5時其MIC值為8μg/ml，pH為8時在最高藥物濃度的條件下白色念珠菌也能很好的生長。

    3.3  接種真菌濃度對MIC值的影響結果  見表1。表1  接種真菌濃度對MIC值的影響結果

    4  討論

培養基的種類及其pH、接種真菌濃度對抗真菌藥物在試管內的抗真菌活性影響很大［2］。如氟康唑在低pH時活性可降低1000倍。甚至同一種培養基，由於pH不同，其抗菌活性也不一樣［3］。因此，國外在研究抗生素和化學合成藥物的抗真菌活性時，對使用的培養基種類及其pH非常重視，常選用不同的培養基和把同一種培養基調整成不同的pH進行研究。國內絕大多數研究者隻用沙氏培養基，對培養基的pH也沒有進行調整，所以可能影響某些藥物的抗真菌效果。pH的不同可能是藥物在兩種不同培養基中的MIC不同的原因之一。在不同的實驗中，實驗條件不盡相同，需要接種與積累的菌量不同。所以需考察接種真菌菌液濃度對藥物敏感性的影響。如表1所見接種真菌量在102、103、104、105、106cfu/ml時，PLAB對白色念珠菌的MIC分別為2、4、8、8、32μg/ml。隨著接種菌量的增加，最低抑菌濃度也增加，這可能與藥物需作用於真菌細胞的數量有關，接種菌量的大小直接影響抗真菌藥物的抗菌效果。在一般情況下，在一定範圍內，接種的菌量越大，藥物的抗菌效果往往就越差。如很多研究者在做中藥抗絲狀真菌實驗時，直接從菌種中取一小塊菌塊接種到含藥培養基中。這樣，不同研究者取的菌塊大小差別較大，甚至同一研究者在同一批實驗中，在不同的試管中接種的菌量也不一樣，這就會影響中藥抗真菌實驗結果的準確性。這也可能是對同一種藥物，不同研究者所得的結果不一致的主要原因［4］。AmB具有較強的抗白色念珠菌的作用，其抗白色念珠菌的活性依賴於所選擇的實驗條件，體外MIC決定於培養基的種類、培養基的pH值、接種菌量、血清的加入量、培養時間、氧氣的含量等。在改良沙氏培養基的MIC低於在YEPD培養基中的MIC；接種濃度增加，抑菌效果降低；抑菌活性有pH依賴性，在低pH時，藥物的MIC較低，在高pH時，藥物的MIC顯著升高。多年來，抗真菌藥物敏感試驗方法不統一，與體內藥效不完全一致，以致發展緩慢。美國國家臨床實驗室標準委員會的抗真菌藥物敏感性試驗專門委員會於1992年公布了世界第一個試驗標準M27-P（NCCLS），酵母菌液體培養基稀釋法抗真菌藥物敏感性實驗的參考方法，用於規範藥物敏感性實驗的方法，以使得所得的實驗結果更加可信，更加有利於指導臨床用藥。

 

作者：劉麗英，董小青，王丹敏《中華醫學研究雜誌》

  1 劉運德.微生物學檢驗.北京：人民衛生出版社，2004，150-151.

2 劉偉，李若瑜.抗真菌藥物敏感性試驗在真菌感染防治中的作用.中華檢驗醫學雜誌，2005，28（4）：349-351.

3 關洪全.抗真菌中藥研究方法學的幾點思考.中國中醫基礎醫學雜誌，2000，6（6）：404-406.

4 Kazuo Iwata,Yoshinori Yamamoto,Hideyo Yamaguchi,et al.In vitro studies of Aculeacin A,a new antifungal antibiotic.J Antibiotics.1982,35(2):203-209.