病原菌與宿主的相互作用，是構成感染的基本因素。現代分子生物學的發展推動病原菌與宿主相互作用研究進入到了分子水平。應用基因芯片轉錄組學分析技術，可以對病原菌入侵宿主以及宿主的防禦抵抗進行轉錄組學研究。從病原菌全基因組水平以及感染宿主的基因水平闡述病原菌與宿主之間的相互關係。闡明病原菌入侵以及宿主抵抗病原菌的分子機製，本文將對病原菌在感染宿主過程中的轉錄組學研究進展進行簡要綜述。
1 病原菌與宿主的相互作用
細菌性感染的發生和發展是病原菌與宿主相互作用的結果。感染的本質是病原性細菌為達到在宿主內生存和繁殖的目的，與宿主的各種抵禦因素發生相互作用。在此期間，既有病原菌為逃避宿主防禦機製而進行的適應，也有宿主為清除病原菌而調動防禦體係的努力。從細菌的角度講，由原寄生地侵襲到宿主時，環境中各種營養物質的含量、種類、溫度、滲透壓與酸堿度等因素的改變，以及宿主對細菌的抵抗，必然對細菌的生存施加巨大壓力。為了生存，細菌能夠快速敏感地監測環境中各種因素的變化，迅速地調節本身的結構，調節其生理、生命行為，達到適應新的環境，在宿主體內寄生，感染宿主目的。對於宿主來說，真核生物有著極其完善的信號轉導係統，可以感知病原菌的侵入，啟動嚴密的防禦係統來抵抗病原菌的入侵。有些宿主還可以分泌一些殺菌素樣的物質，導致病原菌不能在其體內生存，維持自身的正常生理狀態。病原菌與宿主相互作用研究一直是控製感染性疾病發生的一個關鍵環節。
2 細菌的基因芯片轉錄組學研究
隨著基因測序技術的發展與成熟，使得大量微生物基因組的序列測定完成。標誌著基因組學的研究由結構基因組學進入了功能基因組學時期。轉錄組學研究是功能基因組學研究的一個重要手段。Velculescu和Kinzler等人於1997年首先提出轉錄組概念［1］。轉錄組學是從一個細胞中的基因組全部mRNA水平研究基因表達情況。轉錄組學研究作為一種宏觀的整體論方法改變了以往選定單個基因或少數幾個基因零打碎敲式的研究模式［2］，將基因組學研究帶入了一個全新的高速發展時代。
基因芯片轉錄組學研究是應用全基因組芯片對不同條件下細菌的mRNA進行平行分析，可以獲得細菌在不同條件下所發生的差異變化基因，從基因水平上揭示基因表達的差異。該技術的反應原理是通過對不同來源的mRNA進行逆轉錄，而後分別用不同顏色的熒光素標記成探針,探針混合後與芯片上的基因進行雜交,再通過掃描儀掃描，獲得兩份樣品中RNA的相對豐度，結合已有生物信息學資源對數據進行生物學解讀。
基因芯片技術的發展，為研究病原菌與宿主相互作用提供了全新的研究機會。通過基因芯片轉錄譜分析細菌感染宿主表達譜的差異，可以在全基因組範圍獲得細菌為適應在宿主體內生長而表現的基因表達差異，通過對差異表達基因的生物信息學分析可以篩選到病原體在體內存活必需表達的基因，預測與致病性密切相關的毒力基因。從而有助於進一步闡明致病菌的致病機製。芯片轉錄譜技術為大規模發現及鑒定病原菌致病基因提供了一個快速、有效的平台。
3 病原菌與宿主相互作用體外轉錄組學研究進展
應用轉錄譜芯片進行病原菌與宿主相互作用研究經曆了體外與體內兩個階段。首先是應用病原菌與感染宿主細胞在體外進行相互作用，通過體外細胞來模擬病原菌感染宿主的微環境，獲得病原菌與宿主細胞之間的相互作用規律，從而間接反應病原菌入侵宿主的轉錄特征與分子作用機理。
目前對多種病原菌與多種體外細胞包括上皮細胞、內皮細胞接觸以及侵染多形核白細胞（PMNs）單核／巨噬細胞過程中基因表達變化進行了體外轉錄組學研究。通過以上研究，發現了大量微生物的毒力相關基因，存活必須基因，以及在感染過程中細菌重要的酶類和轉運蛋白相關基因等。闡述了病原菌在入侵宿主過程中的相關分子機理，為進一步控製感染的發生奠定了理論基礎。
世界人口的一半以上感染有幽門螺杆菌。其中隻有20%的感染者會表現出臨床症狀。其原因可能在於感染不同類型的幽門螺杆菌以及感染宿主的不同反應。在對幽門螺杆菌致病機理的研究中，芯片轉錄譜技術被廣泛應用。這些研究當中包括大量的幽門螺杆菌與胃上皮細胞共同作用後的轉錄譜研究［3～6］。例如Kim等通過對幽門螺杆菌與胃癌細胞AGS相互作用的研究結果表明［7］，在幽門螺杆菌與AGS細胞相互作用後，幽門螺杆菌毒力島相關基因，動力相關基因，外膜蛋白相關基因發生了轉錄水平的上調。而在轉錄下調的基因當中包括壓力反應蛋白基因與過氧化物分解相關基因。研究結果表明上述基因在幽門螺杆菌粘附胃上皮細胞中發揮了重要作用，與其致病能力緊密相關。
2007年10月薛建江等：病原菌感染宿主的轉錄組學研究進展第5期2007年10月河北北方學院學報（醫學版）第5期細菌性腦膜炎是兒童最常見的死亡病因，腦膜炎奈瑟氏菌為腦膜炎的病原菌。Dietrich等對該細菌在侵入機體中所遇到的兩個主要階段進行了轉錄譜的研究［8］以獲得該病原菌在侵入機體以及適應機體的改變。通過對腦膜炎奈瑟氏菌與上皮細胞（Hela細胞）與內皮細胞（HBMEC人腦血管內皮細胞）相互作用而獲得該細菌和兩種細胞相互作用的轉錄譜，獲得了該細菌在感染不同階段所進行的轉錄水平的不同變化，揭示了腦膜炎奈瑟菌在感染不同階段的分子致病機理。Schubert等人也對該菌進行了類似的轉錄譜研究［9］，表明在腦膜炎奈瑟菌與HBMEC相互作用中，該菌的莢膜起到了極為重要的作用。更進一步揭示了腦膜炎奈瑟菌與宿主細胞在分子水平的相互作用。
4 病原菌與宿主相互作用體內轉錄組學研究進展
在病原菌與感染宿主體內轉錄譜研究中，困擾所有微生物學工作者的一個重要問題就是存在一些技術上的難題，這些技術上的難題限製了體內進行病原與宿主相互作用的轉錄譜研究。這些技術上的難題主要包括原核生物mRNA的穩定性問題，宿主細胞RNA的幹擾，以及宿主細胞與感染細胞的難以分離。基因芯片研究需要大量的mRNA靶分子，大多數研究所用的mRNA是從大量細胞中提取出來的，然而，感染宿主組織中很難提供如此大量的感染細菌mRNA來進行轉錄譜的研究。
對於上述問題的存在，可以通過提高芯片檢測的靈敏度，開發可重複有效擴增RNA靶分子的技術而使問題得到解決。目前有兩種方法在擴增RNA靶分子方麵顯示出一定優勢。其一是利用PCR技術建立單細胞cDNA文庫，這種方法能夠有效且可重複的擴增mRNA分子，但是往往不能保證所得到的DNA文庫中的拷貝數與其在細胞中的拷貝數一致。其應用需通過應用統計方法對數據進行歸一化處理［10］。另一種方法是應用DNA合成和模板指導下的體外轉錄反應來完成的RNA體外線性擴增［11］。通過體外擴增RNA可以將微量的mRNA在體外進行放大，從而可以滿足芯片檢測需要。與構建文庫的方法相比，這種擴增方法更具線性，更能反應真實情況。該研究方法的出現，可以為解決在研究病原與宿主相互作用的轉錄譜研究中RNA量的問題。相信隨著該項技術的逐步完善，體內轉錄譜的研究將會更為廣泛的開展。
Lathem等人應用RNA線性擴增技術對造成小鼠實驗性肺鼠疫中感染48h的鼠疫菌進行了擴增［12］。該研究使用裂解液成功的將鼠疫細菌與肺組織細胞進行了分離，對分離到的RNA進行了擴增，進行了鼠疫菌造成肺鼠疫轉錄譜研究。研究結果表明，與鼠疫菌致病相關的主要毒力因子在體內感染多數表現為高表達。例如T3SS中的基因，鐵攝入以及鐵貯存的相關基因，通過芯片轉錄譜研究對鼠疫菌引起宿主感染的分子致病機理進行了闡述。
霍亂是以嚴重腹瀉為主要症狀的感染性疾病，其病原菌為霍亂弧菌。已經完成該菌的全基因組序列表明，其全基因組包含大小兩個片段。大片段編碼了霍亂弧菌大部分的基因，而小片段的基因功能則很少了解。Xu等應用芯片轉錄譜技術對分布於不同片段的基因進行了感染家兔體內轉錄譜的研究［13］，一方麵，通過研究了解該細菌在感染宿主體內的基因轉錄情況，另一方麵的目的是揭示小片段的基因組在感染過程中的功能。研究者通過創造性的將家兔小腸進行結紮，從而形成小腸結紮環模型，將霍亂弧菌注入結紮環內，感染一定時間後將細菌從結紮環內進行收集，收集RNA後與體外營養環境中培養的細菌進行比較，從而獲得了霍亂弧菌體內感染的轉錄譜。研究結果表明，在發生轉錄明顯改變的基因中大部分為大片段染色體基因。揭示了在感染家兔小腸體內該細菌的一些高轉錄基因包括與動力化學趨向性相關的一些基因，以及與腸內定值相關的一些基因以及與毒素產生相關的基因。對霍亂弧菌的分子致病機理進行了闡述。
空腸彎曲菌是引起腹瀉的主要病原菌。該菌在小腸內成功的粘附與定植是構成其致病力的關鍵因素。Stintzi等人同樣應用小腸結紮環的方法對空腸彎曲菌進行了感染新西蘭白兔小腸的研究［14］。通過對該菌在小腸內生存所進行的轉錄譜研究，獲得了大量與其在腸內生存相關的基因，對其致病機理進行了分子水平的研究。
Snyder等人應用芯片轉錄譜技術對引起泌尿感染的致病性大腸埃希氏菌進行了體內轉錄譜的研究［15］。該研究將從感染小鼠的尿液中直接提取細菌RNA，得到了該細菌在感染宿主體內的多個毒力與代謝因子。在與泌尿係感染相關的基因當中，有這樣一些基因高表達。菌毛基因相關的莢膜形成，微生物素分泌，鐵攝入相關基因轉錄水平明顯上調，表明這些基因與大腸杆菌的致病性密切相關。
在對感染細菌與宿主相互作用研究中，不同的研究者應用了不同的方法進行了研究。例如通過對無菌部位的液體標本直接進行分離來獲得研究所需要的細菌量，Orihuela對感染小鼠血液中細菌采用離心的方法進行分離［16］，通過差速離心的方法將感染小鼠血液中的肺炎球菌與血細胞進行了分離，進行了肺炎球菌感染小鼠體內的轉錄譜研究，獲得了該細菌感染體內的特征性轉錄譜，對其致病機理進行了研究。Talaat等則應用全基因組引物GDP對感染組織內未進行細菌與細胞分離的結核分枝杆菌直接進行逆轉錄［17］，獲得了感染體內結核分枝杆菌的轉錄譜，對結核分枝杆菌的分子致病機理進行了研究。Merrell等應用直接分離的方法對霍亂病人的米泔樣糞便中的霍亂弧菌進行了分離並進行了轉錄譜研究［18］。Graham等應用全基因組芯片對引起化膿性感染的A族鏈球菌M1株進行了感染小鼠上皮組織的轉錄譜研究［19］，解釋了在形成化膿性感染過程中參與的主要基因功能類群，包括毒力基因、氧化壓力基因、氨基酸利用、二元調控係統等基因在皮膚軟組織感染中的作用。對A族鏈球菌引起的化膿性感染的分子機理進行了闡述。Roos等人則通過收集患者尿液中大腸埃希菌83792株直接與體外培養的相同細菌進行了轉錄譜研究［20］。指出在該菌株致病過程中NO代謝相關基因具有非常重要的意義。同樣是對尿液中的大腸埃希菌83792株，Hancock等人則進行了該菌在體內與生物膜形成的相關分子機製研究［21］，揭示了該菌在形成致病中生物膜所起的作用以及與生物膜形成的相關基因。更進一步的闡述了大腸埃希菌83792株導致泌尿係感染的分子致病機理。
5 結論
基因芯片轉錄譜技術在研究細菌與宿主相互作用中展示了其應用優勢,極大地推動了相關研究的發展。結合原核生物基因組序列資料，通過芯片轉錄譜研究可以在基因水平描繪細菌如何適應宿主環境，以及為適應宿主環境所作出的基因改變。揭示細菌與環境相互作用的代謝途徑、細菌的致病毒力因子以及病原菌的分子致病機製。從而為進一步控製細菌性感染的發生奠定理論基礎。
作者：薛建江 邱景富 《河北北方學院學報》
【參考文獻】
1 Velculescu VE, Zhang L, Zhou W, et al. Characterization of the yeast transcriptome［J］. Cell, 1997, 88:243251
2 Mahan MJ, Slauch JM, Mekalanos JJ. Selection of bacterial virulence genes that are specifically induced in host tissues［J］. Science, 1993, 259:686688
3 Bach S, Makristathis A, Rotter M, et al. Gene expression profiling in AGS cells stimulated with Helicobacter pylori isogenic strains (cagA positive or cagA negative)［J］. Infect Immun, 2002, 70:988992
4 Cox JM, Clayton CL, Tomita T, et al. cDNA array analysis of cag pathogenicity islandassociated Helicobacter pylori epithelial cell response genes［J］. Infect Immun, 2001, 69:69706980
5 Maeda S, Otsuka M, Hirata Y, et al. cDNA microarray analysis of Helicobacter pylorimediated alteration of gene expression in gastric cancer cells［J］. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 284:443449
6 Sepulveda AR, Tao H, Carloni E, et al. Screening of gene expression profiles in gastric epithelial cells induced by Helicobacter pylori using microarray analysis［J］. Aliment Pharmacol Ther, 2002, 16(2):145157
7 Kim N, Marcus EA, Wen Y, et al. Genes of Helicobacter pylori regulated by attachment to AGS cells［J］. Infect Immun, 72:23582368
8 Dietrich G, Kurz S, Hubner C, et al. Transcriptome analysis of Neisseria meningitidis during infection\[J\]. J Bacteriol, 2003, 185:155164
9 SchubertUnkmeir A, Sokolova O, Panzner U, et al. Gene expression pattern in human brain endothelial cells in response to Neisseria meningitidis\[J\]. Infect Immun, 2007, 75:899914
10Handfield M. Levesque RC: Strategies for isolation of in vivo expressed genes from bacteria［J］. FEMS Microbiol Rev, 1999, 23:6991
11Zhao H, Hastie T, Whitfield ML, et al. Optimization and evaluation of T7 based RNA linear amplification protocols for cDNA microarray analysis［J］. BMC Genomics, 2002, 3:31
12Lathem WW,
13Xu Q, Dziejman M, Mekalanos JJ. Determination of the transcriptome of Vibrio cholerae during intraintestinal growth and midexponential phase in vitro［J］. Proc Natl Acad Sci
14Stintzi A, Marlow D, Palyada K, et al.Use of genomewide expression profiling and mutagenesis to study the intestinal lifestyle of Campylobacter jejuni［J］. Infect Immun, 2005, 73:17971810
15Snyder JA, Haugen BJ, Buckles EL, et al. Transcriptome of uropathogenic Escherichia coli during urinary tract infection［J］. Infect Immun, 2004, 72:63736381
16Orihuela CJ, Radin JN, Sublett JE, et al. Microarray analysis of pneumococcal gene expression during invasive disease［J］. Infect Immun, 2004, 72:55825596
17Talaat AM,
18Merrell DS, Butler SM, Qadri F, et al. Hostinduced epidemic spread of the cholera bacterium［J］. Nature, 2002, 417:642645
19Graham MR, Virtaneva K, Porcella SF, et al. Analysis of the transcriptome of group a streptococcus in mouse soft tissue infection［J］. Am J Pathol, 2006, 169:927942
20Roos V, Klemm P. Global gene expression profiling of the asymptomatic bacteriuria Escherichia coli strain
21Hancock V, Klemm P. Global gene expression profiling of asymptomatic bacteriuria Escherichia coli during biofilm growth in human urine.[J]. Infect Immun, 2007, 75:966976
