毛細管區帶電泳法分離大腸埃希菌定量研究

【摘要】  目的：定量研究毛細管區帶電泳法（CZE）分離大腸埃希菌（E.coli）以滿足臨床診斷要求。方法：用毛細管區帶電泳法對E.coli ATCC25922進行分離，研究其峰高與E.coli量的關係。結果：毛細管區帶電泳法分離E.coli ATCC25922濃度在105cfu/ml～5×107cfu/ml之間線性很好，其峰高與濃度關係符合線性方程：㏑mAU＝﹣5.256＋1.0036×㏑C, R2＝1。結論：CZE法分離大腸埃希菌可進行定量研究。

【關鍵詞】  毛細管區帶電泳；分離；大腸埃希菌

    [Abstract]   Objective:A quantitative study about determination of Escherichia coli （E.coli）by capillary zone electrophoresis（CZE） was to meet the clinic diagnosis request. Methods:We determined E.coli ATCC25922 by CZE and studied the linear relationship between the peak height (mAU) and the Escherichia coli concentration (C). Results:The linear relationship of  E.coli ATCC25922 concentration determined by CZE between 105cfu/ml and 5×107cfu/ml was quite good. Regression line equation is ㏑mAU＝﹣5.256＋1.0036×㏑C, R2＝1.Conclusion: Escherichia coli ATCC25922   determined by capillary zone electrophoresis could be used for a quantitative study.

    [Key words]   Capillary zone electrophoresis； Separation； Escherichia coli大腸埃希菌是臨床常見感染菌之一，由其引起的泌尿係統感染占53.6%[1]，其診斷主要靠細菌培養法定量分析，但該法耗時較長（通常需2～4天）。毛細管區帶電泳是20世紀80年代發展起來的一種高效分離技術，具有快速、靈敏、低耗等優點，可用於研究多種細菌的分離[2]。毛細管區帶電泳法分離大腸埃希菌ATCC25922定量研究，將有利於快速診斷，滿足臨床要求。

    1   材料和方法

    1.1   儀器   Beckman-Coulet P/ACE MDQ 毛細管電泳儀和 UV檢測器, 河北永年銳灃色譜器件公司未塗層石英矽毛細管（內徑75μm），上海天達pHS-3TC pH計（0.01級）。

    1.2   試劑和菌株來源   聚氧化乙烯（PEO）、Tris和EDTA(Sigma-Aldrich公司)，硼酸、氫氧化鈉、鹽酸（上海化劑廠分析純級），實驗用水為雙蒸餾水。采用上述材料配製TBE貯存緩衝液（4.5mmol/L TRIS-4.5mmol/L硼酸-0.1mmol/L EDTA，pH8.6），將其1∶16稀釋，添加終濃度為0.0125%的PEO(Mn 600000)，並用0.1mmol/L NaOH和鹽酸調整pH至9.0，作為電泳緩衝液待用。E.coli ATCC 25922（衛生部臨床檢驗中心）。

    1.3   方法

    1.3.1   電泳方法   采用內徑75μm、有效長度（進樣端至檢測窗口）為40cm的石英毛細管，陽極0.5psi壓力進樣20s，電壓25kV，電泳時間15min，25℃恒溫，陰極檢測，波長214nm。開機後及每一份標本檢測前依次用1.0mol/L氫氧化鈉、 雙蒸餾水、電泳緩衝液20psi衝洗毛細管5min。

    1.3.2   檢測方法   將血瓊脂平板上經35℃，18~24h培養的E.coli ATCC 25922的菌落挑於電泳緩衝液中，配成5×107、107、106、5×105和105cfu/ml，靜置30min後進行毛細管區帶電泳。

    1.4   統計學方法   使用SPSS 11.5 for windows 軟件對數據進行統計學分析。

2   結      果

    2.1   CZE分離E.coli定量電泳圖   在相同條件下，應用毛細管區帶電泳法分離濃度為5×107、107、106、5×105和105cfu/ml的大腸埃希菌,譜峰高度分別為316、61、6.2、2.84和0.62 mAU（毫吸光度），峰形尖銳，分離效率高。電泳圖譜見圖1。        

    2.2   CZE分離E.coli峰高與濃度的線性關係   根據5次定量試驗結果，對大腸埃希菌濃度（C）和相應檢測的峰高（mAU）分別取對數，以㏑C為橫坐標，㏑mAU為縱坐標，作回歸曲線，線性方程為：㏑mAU＝-5.256＋1.0036×㏑C,R2＝1。

    3   討      論

    細菌為膠體顆粒，比表麵積極大，且覆蓋著多糖類、肽聚糖、脂類等物質，這些化合物在電泳緩衝液中可因解離和吸附形成雙電層；因而，毛細管區帶電泳將細菌當作“離子”看待，以高壓直流電場為驅動力，以毛細管為分離通道，在電滲流作用下達到高效聚焦和分離[3，4]。毛細管區帶電泳法已成功分離了多種細菌，並取得非常高的分離峰效應（高達10-9表觀理論塔板/m）[5]。我們發現大腸埃希菌ATCC25922通常保持較高的存活率，極易聚集出現雜峰，影響分離度。消除聚集可在電泳前使大腸埃希菌與運行緩衝液充分混勻後靜置30min以利於緩衝液和添加劑充分與大腸埃希菌作用，形成相對穩定的單個離子減小聚集。

    本研究顯示毛細管區帶電泳法分離大腸埃希菌濃度在105～5×107cfu/ml時定量實驗敏感性好、分離效率高，峰高與大腸埃希菌濃度的線性關係較好，可依據峰高用回歸方程分析大腸埃希菌濃度, 回歸方程：㏑mAU＝-5.256＋1.0036×㏑C,R2＝1；對於菌量<105cfu/ml，本試驗可將菌液進行10倍濃縮，提高濃度後檢測。

隨著毛細管區帶電泳技術自動化操作的實現，利用其快速、高效、重複性好等優點，為臨床快速、批量分離和分析微生物提供了一個很好的選擇性手段[6]。盡管毛細管區帶電泳法分析微生物還存在著一些亟待解決的問題[7]，但本研究顯示經過實驗條件的優化，其在微生物的分離和分析中可以得到很好的結果；毛細管區帶電泳法分離大腸埃希菌，操作簡便、快速、靈敏度高、溶劑消耗少、環境汙染小，具有較高的研究價值和前景。

 

   作者：王朔　王惠民，褚少朋，汪桂華 《南通大學學報（醫學版）》

  [1] 喻 華,劉 華,顏英俊,等.尿路感染病原菌分布及耐藥性檢測[J].中華醫院感染學雜誌,2003，13（10）:983.

[2] 鄧延倬，何金蘭. 高效毛細管電泳[M].第1版.北京：科學出版社，2000：5.

[3] Jinjian Zheng,Edwardm S Yeung. Mechanism of microbial aggregation during capillary electrophoresis[J]. Anal Chem, 2003,75: 818-824.

[4] Meera J Desai，Daniel W. Armstrong. Separation, identification, and characterization of microorganisms by capillary electrophoresis[J]. Microbiology and Molecular Biology Reviews,2003, 67（2）:38-51.

[5] Armstrong, DW, Schneiderheinze JM. Rapid identification of the bacterial pathogens responsible for urinary tract infections using direct injection CE[J]. Anal Chem, 2000,72（2）:4474-4476.

[6] 林炳承.毛細管電泳導論[M].第1版. 北京：科學出版社，1996：76.

[7] Armstrong, DW, Girod M, He L, et al. Mechanistic aspects in the generation of apparent ultra-high efficiencies for colloidal (microbial) electrokinetic separations[J]. Anal Chem, 2002,74（3）:5523-5530.