肺炎鏈球菌轉化模型的建立

【摘要】  目的： 建立一種更加穩定、高效的肺炎鏈球菌實驗室轉化模型，以便於對該菌的各種目的基因進行重組改造. 方法： 分別用改進方法和既往方法製備肺炎鏈球菌感受態細胞，轉化外源DNA，獲取發生了轉化的菌株，通過抗生素培養基培養和PCR鑒定是否發生轉化；並計數抗生素篩選平板上的轉化菌落，比較兩者的轉化率，以確定更佳的轉化模型. 結果： 肺炎鏈球菌334菌株、31203菌株用改進方法的轉化率分別為（0.89±0.20）％，（0.71±0.10）％，高於既往方法的轉化率［分別為(6.2±1.4)×10-3％，(5.7±1.1)×10-3 ％］，構建了肺炎鏈球菌感受態缺陷菌株，建立了改進的肺炎鏈球菌實驗室轉化模型. 結論： 改進的轉化模型實現了穩定的肺炎鏈球菌實驗室轉化，能方便研究者對該菌進行各種遺傳操作，為深入研究其致病的分子機製提供了一個技術平台.

【關鍵詞】  肺炎鏈球菌；轉化，細菌；感受態

　　【Abstract】 AIM: To establish a transformation model of Streptococcus pneumoniae(S.pn) in laboratory to promote the transformation efficiency and reconstruct its chromosome gene by improving the previous transformation method. METHODS: The competence cells of S.pn were prepared using both the previous and improved methods. After the exotic DNA was transformed under certain cell density, the transformed colonies on antibiotic plate, which was identified by growing in antibiotics culture and PCR, were counted to compare their transformation rate. RESULTS: The improved transformation model of S.pn in laboratory was established. The transformation rate of S.pn 334 was （0.89±0.20）％ and S.pn 31203 was （0.71±0.10）％ under the improved transformation model, which was relatively higher. Using this model, we constructed 4 S.pn competencedefective strains. CONCLUSION: In laboratory, the improved transformation model can raise the transformation rate of S.pn, which induces different S.pn into competence, and provides a research technology for further investigation on pneumococcal pathogenesis.

 

　　【Keywords】 occus pneumoniae; transformation, bacterial; competence

　　0  引言

   

　　轉化是指細菌在自然生長狀態下可自發形成感受態（特指細菌能夠攝取外來遊離DNA的一種狀態），攝取外源性DNA，通過同源重組導致基因發生改變的過程. 通過轉化可以改造細菌基因，進行功能基因組研究，它是研究肺炎鏈球菌（S.pn）生物學功能的重要手段. 本課題組既往的S.pn實驗室轉化模型［1］有兩大弊端：一是轉化效率不穩定；二是感受態開放時間較短，不能滿足大規模轉化的需要. 有研究［2］認為冷刺激可能會延長感受態開放時間，我們據此對既往轉化模型進行改良，即冷凍處理細胞後再做轉化，以期克服其弊端.

　　1  材料和方法

　　1.1  材料   S.pn血清4型標準菌株TIGR4(ATCCBAA334)，幹粉（美國ATCC微生物菌種保存中心）；S.pn血清3型標準菌株CMCC(B)31203，幹粉（中國藥品生物製品檢定所醫學微生物菌種保存中心）；SⅡ型S.pn(1和2號菌株)由中國醫科院提供；主要遺傳特征經鑒定合格. C+Y培養基：含5 g/L Yeast提取物（Lacks and Hotchkiss, 1960）；TSA 血平板：含50 mL/L兔脫纖維全血. 感受態刺激因子（CSP2）由挪威生命科學大學Havarstein LS教授惠贈；S.pn CP1250的染色體DNA（含有鏈黴素抗性基因str）由美國Morrison教授惠贈；S.pn 1d菌株的基因組DNA(含紅黴素抗性基因erm 的comE斷裂基因)由本課題組構建［3］；DNA提取試劑盒（上海華舜公司）；牛血清白蛋白（BSA，Sigma公司）；胰蛋白腖、大豆蛋白腖（Gibco公司）. 722分光光度儀（上海儀器分析三廠）；-80℃低溫冰箱（日本SANYO Medical freezer MDF330型）.

　　1.2  方法

　　1.2.1  S.pn的生長曲線繪製  挑取S.pn單個菌落接種於C+Y培養基，37℃培養12 h，轉接於20 mL C+Y培養基中，於37℃水浴孵育，從1 h後開始在分光光度儀上測菌液A620 nm值，之後每隔1 h取樣1次. 以時間為橫坐標，吸光度為縱坐標繪製細菌的生長曲線.

　　1.2.2  改進的S.pn實驗室轉化模型的建立

　　1.2.2.1  改進的S.pn實驗室轉化模型  取凍存於-80℃冰箱的S.pn菌株，培養於CTM培養基（含C+Y培養基，1 mmol/L CaCl2，0.1 g/L BSA）中，37℃水浴至A550 nm＝0.1左右時，將甘油加入上述菌液中，至其終濃度為100 mL/L，分裝後凍於-80℃，此即為S.pn感受態細胞；24 h後取出凍存菌液，在冰上融化，9000 g離心1 min，棄去上清液，加入100 μL C+Y培養基（pH8.0），使沉澱徹底懸浮，加入CSP20 μg/L，同時加入S.pn CP1250的染色體DNA 100 μg/L，於37℃孵育90 min，鋪於含200 mg/L鏈黴素的TSA血平板上，於37℃孵箱培養24～48 h，即得到轉化菌落.

 

　　1.2.2.2  方法學比較  取凍存於-80℃冰箱的S.pn菌株，分別用上述改進方法和既往方法［1］製備S.pn感受態細胞，然後加入CSP2 20 μg/L，並加入S.pn CP1250的染色體DNA100 μg/L，於37℃孵育90 min，鋪於含200 mg/L鏈黴素的TSA血平板上，於37℃孵箱培養24～48 h，計數抗生素血平板上的轉化菌落. 轉化率=平板菌落數/細菌總數×100%. 其中，細菌總數按A620 nm=0.6時， 細菌數為5 × 1011 cfu／L計算.

　　1.2.3  S.pn感受態缺陷菌株的製備及鑒定

　　1.2.3.1  感受態缺陷菌株的製備  用上述改進的轉化方法製備S.pn感受態細胞，然後加入CSP2 20 μg/L，及含comE斷裂基因的染色體DNA（即S.pn 1d菌株DNA）100 μg/L，於37℃孵育90 min，鋪於含0.25 mg/L紅黴素的TSA血平板上，於37℃孵箱培養24～48 h，挑取平板上的轉化菌落，接種於含0.25 mg/L紅黴素的C+Y培養基中，37℃培養增菌，當菌密度為A620 nm=0.2左右時，凍於－80℃冰箱保存，即得到缺陷菌.

　　1.2.3.2  感受態缺陷菌株的鑒定  鑒定1：將野生菌和缺陷菌同時做轉化，選用CP1250的DNA為外源基因. 鑒定2：提取野生菌和缺陷菌的染色體DNA，用comE（5′TGCTCAGTCAATTGTCTATGCTCG3′，5′ACCAACGGACCTTCTATCTGTAGC3′）和erm（5′CCGGGCCCAAAATTTGTTTGAT3′， 5′AGTCGGCAGCGACTCATAGAAT3′）的引物［4］做PCR. 加入comE或erm的上、下遊引物5 μmol/L，加入MgCl2 2.5 μmol/L，Taq plus DNA聚合酶1 U. 循環參數為95℃ 5 min預變性；94℃ 1 min, 55℃ 1 min, 72℃ 1.5 min, 30個循環；72℃ 10 min. 15 g/L瓊脂糖凝膠電泳鑒定.

   

　　統計學處理：根據資料類型采用t檢驗，以P<0.05為差別有統計學意義(雙側).

2  結果

　　2.1   S.pn的生長曲線   S.pn菌株334和31203的生長曲線無明顯差別，生長情況基本一致（圖1）.

　　圖1  肺炎鏈球菌334和31203菌株的生長曲線（略）

　　2.2  改進的S.pn實驗室轉化模型   獲得S.pn 334和31203菌株的轉化菌株，轉化率分別為1.03％和0.82％. 方法學比較實驗結果顯示，S.pn菌株334和31203用改進轉化模型後，兩株細菌的轉化率皆比用既往轉化模型的轉化率高兩個數量級，差異有統計學意義（P<0.05，表1），改進轉化模型的轉化效率明顯優於既往轉化模型.

　　表1  肺炎鏈球菌（S.pn）334和31203菌株用不同轉化模型的轉化率比較（略）

　　aP<0.05 vs 既往方法.

　　2.3  S.pn感受態缺陷菌株的獲得  利用含comE斷裂基因的染色體DNA轉化S.pn 334，31203，1和2號菌，分別得到轉化菌落，即為S.pn感受態缺陷菌，轉化率分別為0.90％，0.75％，6.80％和9.40％. 鑒定1：將野生菌和缺陷菌同時轉化抗鏈黴素(str)的DNA，野生菌獲得轉化菌株，而缺陷菌無一個菌落生長. 鑒定2：以野生菌和缺陷菌的染色體DNA為模板，以comE和erm的引物做PCR，缺陷菌分別在1515 bp和726 bp處有產物，而野生菌則無這兩個片段的產物（圖2）.  

 

　　M： 2000 bp ladder DNA maker；1～4：獲得的S.pn 334，31203，1，2號菌株的感受態缺陷菌DNA含有erm基因；5～8：獲得的S.pn 334，31203，1，2號菌株的感受態缺陷菌DNA含有com E斷裂基因.

　　圖2  肺炎鏈球菌感受態缺陷菌株（略）

　　3  討論

   

　　S.pn是自然界可以發生自然轉化的一種條件致病菌，在目前發現的可以發生自然轉化的幾種細菌中，S.pn的轉化率最高［5］. 轉化後可發生基因同源重組，因而還是基因敲出、基因突變的有利工具，對於細菌功能學的研究很有幫助，因此我們需要掌握S.pn在實驗室的穩定、高效的轉化模型，以便於對其基因功能以及致病機製進行深入研究. S.pn的轉化受密度感應係統的控製，當細菌生長到一定密度時，感受態會受到抑製，自然狀態下，S.pn感受態開放時間僅十幾分鍾，所以很難在實驗室條件下捕捉到S.pn的自然轉化. 人工純化合成的CSP能誘導S.pn轉化，使S.pn在實驗室轉化成為現實. 然而既往的轉化模型不夠穩定，且不適合大量連續的實驗室轉化，有待改進. S.pn的莢膜較厚，會妨礙外源DNA的轉入，冷凍處理可能會減弱S.pn莢膜的形成，使其轉化率增加［6］，且有研究認為冷刺激會延長細菌感受態開放時間，因此我們在細菌自然生長合適的菌密度時（許多研究認為此時S.pn處於自然轉化期）冷凍S.pn感受態細胞，然後利用CSP進一步誘導S.pn轉化.

   

　　本課題組的前期實驗［1］已摸索出適合S.pn31203的轉化培養基、pH及培養時間（菌密度）等，我們通過繪製31203菌株和334菌株的生長曲線，發現兩者的生長情況基本一致，因此對334菌株采用相同的轉化體係和條件. 我們的結果顯示，在實驗室條件下，運用選定的轉化體係和條件，能將外源DNA轉入細菌，且改變了細菌的生物學性狀，使其產生了抗生素抗性，成功地建立了改進的S.pn實驗室轉化模型. 兩種菌株采用改進的轉化模型後，其轉化率均明顯高於既往轉化模型，說明冷凍處理感受態細胞能有效提高其轉化率；且改進模型可以一次製備大量S.pn感受態細胞，操作簡便，可連續使用感受態細胞. 因此改進的S.pn實驗室轉化模型相當穩定、高效.

   

　　comE是調控S.pn感受態的關鍵基因，各種環境因素對S.pn轉化發生的調節都是通過直接或間接方式影響comE的表達來實現的［7-8］. 我們選用該基因為目的基因，將含comE斷裂基因的DNA轉入野生菌，得到感受態缺陷菌株，實驗證明這些缺陷菌的確不能發生轉化，可用於下一步相關研究. 說明可以通過穩定的實驗室轉化模型，改造那些具有自然轉化特性的細菌（如S.pn）的各種基因，進而觀察細菌發生的變化. 采用這種模型方便了對細菌進行各種遺傳操作，為深入研究其致病的分子機製提供了一個技術平台.

　作者：趙清，李南，張雪梅，胥文春，朱興華，張群，尹一兵《第四軍醫大學學報》

  　　［1］ 孟江萍，尹一兵，張雪梅，等. 肺炎鏈球菌轉化模型的建立與優化［J］. 微生物學雜誌，2006，26（1）：10-13.

　　［2］ Whatmore AM, Barcus VA, Dowson CG. Genetic diversity of the streptococcal competence (com) gene locus ［J］. J Bactefiol，1999, 181(10):3144-3154.

　　［3］ Zhang XM, Yin YB, Zhu D, et al. The Effect of Transformation on the Virulence of Streptococcus pneumoniae［J］. J Microbiol, 2005, 43(4): 337-344.

　　［4］ Lee MS, Morrison DA. Identification of a new regulator in streptococcus pneumoniae linking quorum sensing to competence for genetic transformation ［J］. J Bacteriol, 1999, 181(16): 5004-5016.

　　［5］ Cvitkovitch DG. Genetic competence and transformation in oral streptococci［J］. Crit Rev Oral Biol Med, 2001, 12(3): 217-243.

　　［6］ Joann H, William EA, Jeffrey A, et al. Genome of the Bacterium Streptococcus pneumoniae Strain R6 ［J］. J Bacteriol, 2001, 183(19):5709-5717.

　　［7］ Echenique JR, Trombe MC. Competence modulation by the NADH oxidase of Streptococcus pneumoniae involves signal transduction ［J］. J Bactefiol，2001，183(2)：768-772.

［8］ Guiral S, Henard V, Granadel C, et al. Inhibition of competence development in Streptococcus pneumoniae by increased basallevel expression of the ComDE twocomponent regulatory system［J］. Microbiology, 2006, 152:323-331.