不同齲敏感者口腔變形鏈球菌基因型與產酸性之間的關係

【摘要】  　　目的： 研究不同齲敏感者口腔變形鏈球菌基因型與產酸性的關係. 方法： ①隨機選取50例24～32歲的高齲、中齲及無齲者，取牙麵菌斑樣本接種於MS培養基上，每人隨機挑取2～5株臨床分離株，提取細菌染色體DNA，采用AP-PCR法對不同齲敏感者口腔變形鏈球菌臨床分離株進行基因分型. ②以pH 0.5為間隔配製pH 4.0～7.0係列的，含50 mg/L葡萄糖的MS液體培養基，對不同基因型口腔變形鏈球菌臨床分離株進行厭氧培養48 h，用精密pH計檢測培養基上清液的pH值. 結果： ①14例高齲個體中有3例為1種基因型，5例有2種基因型，6例有3種基因型；9例中齲個體中有4例為一種基因型，3例有2種基因型，2例有3種基因型；13例無齲個體中有12例為1種基因型，1例有2種基因型. ②不同基因型的變形鏈球菌培養基上清液的pH值進行統計學分析，發現基因型越多的細菌其產酸能力越強. 結論： ①齲敏感越高的個體其口腔變形鏈球菌臨床分離株基因型越多；②不同基因型的變形鏈球菌pH值的檢測，基因型越多的細菌其產酸能力越強.

【關鍵詞】  齲敏感者 隨機引物聚合酶鏈法 基因型 鏈球菌 變異

　　Association between genotype and acidogenicity of Streptococcus mutans in subjects with different caries susceptibility

　　【Abstract】AIM: To study the genotype of Streptococcus mutans isolated from different caries-susceptible subjects and to analyse the association of the genotype with acidogenicity of Streptococcus isolates. METHODS: Plaque samples were obtained from 50 children who were 24 to 32 years old and originally plated onto Mitis-Salivarius-Bacitracin agar． Chromosomal DNA was extracted from the isolates obtained from samples by DNA kit. Then genotyping of Streptococcus mutans was carried out by arbitrarily primed polymerase chain reaction(AP-PCR). Streptococcus mutans were inoculated in MS media containing 5 mg/L glucose and with different pH values (4.0～7.0),and grew in anaerobic condition （80 mL/LN2,100 mL/LH2,100 mL/LCO2）at 37℃ for 48 h. The final pH values of the solutions were measured,and then compared. RESULTS： Isolates of Streptococcus mutans were obtained from 36 subjects (total 50 subjects). 101 Streptococcus mutans strains were obtained and 31 genotypes were found. More than one genotype isolates were colonized in the same individual of 14 high-caries subjects,6 possessed three genotypes,5 possessed two genotypes，and 3 had one genotype; of  9 middle-caries subjects,2 possessed three genotypes,3 possessed two genotypes，and 4 had one genotype;of 13 caries free subjects，12 had one genotype,1 possessed two genotypes. Statistical analysis of the final pH values of culture supernatants revealed that the isolates with more genotypes presented the stronger ability of acidogenicity. CONCLUSION： AP-PCR technology can obtain genetic map of Streptococcus mutans. There are more genotypes and the higher acidogenicity of Streptococcus mutans isolates in the high-caries subjects than in the middle-caries and caries-free ones.

　　【Keywords】 caries-susceptible; arbitrarily primed polymerase chain reaction;genotype; streptococcus mutans

　　0   引言

   

　　齲病是人類常見病，不僅破壞人類的咀嚼器官，還可影響全身的營養和發育. 變形鏈球菌(streptococcus mutans)已被公認為齲病的主要致病菌之一［1］，因此，為了有效地防治齲病，對變形鏈球菌的基因分型進行分析，從分子水平研究它的產酸特性是非常重要的. 近年來隨著隨機引物聚合酶鏈反應（arbitrarily primed polymerase chain reaction，AP-PCR）技術的不斷完善，其已被廣泛應用於口腔變鏈菌的基因分型研究中，本實驗我們擬采用AP-PCR對不同齲敏感者口腔中分離出的變形鏈球菌進行基因組指紋分析，並研究變形鏈球菌基因型與變形鏈球菌產酸性之間的關係.

　　1   材料和方法

　　1.1   材料   AP-PCR采用的隨機引物,參照Mattos-Graner等文獻［2］,序列為：5-TGCCGAGCTG-3 (北京華大中生科技發展有限公司),2×Taq PCR Master Mix, Proteinase K，Lambda DNA/EcoRI+HindⅢ Marker(成都博瑞克生物科技有限公司),瓊脂糖(美國Sigma公司),細菌基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）(北京天跟生物有限公司)，MS培養基（美國BD公司），硫代乙醇轉送液和S．mutans血清型C的標準菌株ATCC25175(四川大學口腔生物醫學重點實驗室微生物室提供)，BHI培養基(美國OXOID LTD 公司). YQX-Ⅱ型厭氧培養箱(上海躍進醫療器械廠),SmartSpec Plus型核酸蛋白測定儀(美國Bio-Rad公司),7300型定量PCR儀(美國ABI公司),凝膠成像係統(美國Bio-Rad公司),PHS-3C型精密pH計（上海精密科學儀器有限公司雷磁儀器廠）.

　　1.2   方法

　　1.2.1   臨床分離株的分離及培養   選擇井岡山大學醫學院學生及青年教職員工自願者為本研究對象. 納入本研究的合格對象共50例，最終分離得到變形鏈球菌的有36例,其中無齲13例，高齲14例，中齲9例，年齡24～25歲. 常規口腔檢查，記錄DMFT、飲食情況、生活習慣. 要求無全身係統性疾病,取樣前3 mo內未服用抗生素. 不同齲敏感者為高齲者(DMFT≥6)，中齲者(6＞DMFT≥4)，無齲者(DMFT＝0). 用無菌刮匙收集無齲者咬合麵窩溝內以及鄰麵的菌斑,有齲者刮取齲壞附近的菌斑於盛有0.5 mL轉送液的EP管中. 取原液，10-1，10-2，10-3 稀釋液各50 μL分別接種於MS平板上，37℃，厭氧（800 mL/LN2，100 mL/LCO2，100 mL/L% H2）培養48～72 h後，將具有深藍色嵌頓，質硬，表麵粗糙，突起，邊緣不齊等典型菌落形態和菌體形態的單個菌落接種於MS平板上，進行次代純培養，增菌後，放在含500 g/L甘油BHI液體的EP管中，用parafilm封口,-20℃儲存備用.

　　1.2.2   臨床分離株的微量生化反應鑒定   用接種環收集複蘇的純培養菌落，混懸於含有1000 μL PBS的EP管中製成濃菌懸液，調整菌液濃度至A550=0.52.用微量加樣槍吸取待測菌濃菌懸液，分別加入96孔酶標反應板微孔中，每孔加兩滴，每種菌懸液加6孔,分別加入一滴10 mL/L的甘露醇液、山梨醇液、棉子糖液、密二糖液、七葉苷基質液，以及精氨酸基質液，以變鏈菌標準菌株ATCC25175為陽性對照,PBS為陰性對照，蓋玻板，37℃孵育24 h，再分別於前4孔加入BM指示劑，精氨酸孔加入Nessler試劑，觀察並記錄顏色變化；七葉苷孔直接觀察顏色改變.

　　1.2.3   提取變形鏈球菌染色體DNA   複蘇臨床分離株，37℃，厭氧（800 mL/LN2，100 mL/LCO2，100 mL/LH2）培養24 h，用無菌接種環收集菌落，采用北京天跟公司提供的基因組DNA快速提取試劑盒分別提取每個分離株的DNA，取少量DNA在核酸蛋白測定儀下測定濃度和純度，並作為AP-PCR中的DNA模板，測A260值、A280值、並計算比值，-20℃貯存.

　　1.2.4   AP-PCR反應條件的確立   反應總體積為25 μL，包括20 mMTris-HCl,每種dNTP各500 μmol/L，3 mmol/L MgCl2，0.1U Taq聚合酶，100 mmol/LKCl,0.3 μmol/L引物，DNA 2～40 ng,不足部分用ddH2O補齊,以臨床分離株染色體DNA為反應模板,在PCR擴增儀中進行循環反應. 反應條件為：94℃預變性5 min，35個循環（94℃1 min，36℃2 min，72℃2 min）後，72℃延伸5 min. 擴增完成後，取10 μL反應混合物進行10 g/L瓊脂糖凝膠(已加溴化乙錠)電泳35～50 min，電壓100～120 V，以Lambda DNA/EcoRI+Hind Ⅲ Marker 為分子量參照標準，在凝膠分析儀上觀察擴增產物帶型.

　　1.2.5   AP-PCR重複性檢測   用確立的AP-PCR最佳反應條件，同一臨床分離株染色體DNA模板，在不同時間進行擴增，檢測所建立的AP-PCR方法的重複性.

　　1.2.6   不同基因型的變形鏈球菌菌懸液的製備   將複蘇48 h的不同基因型的變形鏈球菌菌種接種於BHI培養基中，800 mL/L N2，100 mL/L H2，100 mL/L CO2在37℃下厭氧培養18 h，塗片檢查為純培養後，將菌液在4℃下以3000 r／min離心15 min，收集細菌，無菌生理鹽水洗菌兩次，用無菌生理鹽水調整為A540nm=1.0的菌懸液.

　　1.2.7   不同基因型的變形鏈球菌產酸能力分析   以pH 0.5為間隔配製pH 4.0～7.0係列的，含50 g/L葡萄糖的MS液體培養基. 取各基因型變形鏈球菌臨床分離株菌懸液，按菌液與MS液體培養基1∶10（v/v）比例接種細菌，37℃厭氧培養48 h，每個樣品一式三份. 將各變形鏈球菌臨床分離株48 h培養物經3000  r/min離心15 min，取上清液，於酸度計上測定培養物終末pH值，計算細菌降低pH能力.

　統計學處理：不同齲敏感組問攜帶基因型的統計分析采用SPSS13.0統計軟件中的χ2檢驗，不同基因型的變形鏈球菌培養基pH值影響檢測結果以x±s表示,采用SPSS13.0統計軟件中的方差分析計算.

　　2   結果

　　2.1   不同齲敏感個體攜帶基因型的情況   本研究50例個體中培養出變形鏈球菌有36例，共101株臨床分離株，31種不同的基因型，有5株變形鏈球菌分離株基因型完全相同. 14例高齲個體中有3例為1種基因型，5例有2種基因型，6例有3種基因型；9例中齲個體中有4例為一種基因型，3例有2種基因型，2例有3種基因型；13例無齲個體中有12例為1種基因型，1例有2種基因型. 不同齲敏感性的組別和其所攜帶不同種基因型的數量之間的關係具有統計學意義（Ρ＝0.031，表1，圖1），齲敏感性越高的組別其所攜帶的基因型的數量也越多（表1，圖1）.

　　表1   不同齲敏感個體攜帶基因型的情況（略）

　　χ2＝10.655,Ρ<0.05.

　　1：DNA/EcoRI+HindⅢ 標記; 2～7：不同齲敏感個體變形鏈球菌臨床分離株基因型.

　　圖1   高齲、中齲、無齲個體變形鏈球菌臨床分離株基因型（略）

　　2.2   AP-PCR重複性檢測   在確立的最佳AP-PCR反應條件下，用同一臨床分離株染色體DNA為擴增模板，在不同時間，以不同稀釋度的變形鏈球菌臨床分離株染色體DNA為模板，進行AP-PCR重複性的檢測，產生了相同的擴增產物帶型所得的電泳帶型均一致（圖2）.

　　2.3   不同基因型的變形鏈球菌培養基pH值影響的檢測   將不同基因型的變形鏈球菌加入培養基中厭氧培養48 h後，檢測培養物上清液的pH值，數據采用SPSS13.0軟件統計分析，經方差分析，F＝15.26,Ρ＝0.000，說明三組之間的差別具有統計學意義，基因型越多的細菌其產酸能力越強. 進一步的兩兩比較顯示，各兩組細菌的產酸情況均有統計學差異（P<0.05，表2）.

　　1：DNA/EcoRI+HindⅢ 標記; 2～5：11號無齲個體變形鏈球菌臨床分離株的DNA不同濃度時的基因型； 6～8：6號中齲個體變形鏈球菌臨床分離株的DNA不同濃度時的基因型.

　　圖2   AP-PCR重複性檢測結果（略）

　　表2   不同基因型的變形鏈球菌pH值的檢測結果（略）

　　F＝15.26,P<0.05,不同種基因型的細菌兩兩比較pH值均有統計學差異.

　　3   討論

     

　　齲病是嚴重危害人類口腔健康的一種疾病，細菌是其發生最關鍵的因素. 牙菌斑內的產酸活動是齲損發生的直接原因［3］，致齲菌在菌斑深層缺氧環境中通過糖酵解途徑代謝食物中的糖，在短時間內產生大量乳酸和其他有機酸，並在菌斑內積累，使局部pH值下降. 在致齲菌斑中，變形鏈球菌無疑是產酸力最強的細菌之一，與齲病的發生、發展密切相關. 牙體硬組織脫礦，最終導致齲損的形成［4］.

   

　　AP-PCR是William等［5］於1990年發展起來的一種DNA指紋技術，是利用PCR原理，用一種任意序列的寡核苷酸引物做PCR擴增，獲得一定的條帶模式即指紋圖譜，該指紋圖譜通過增加隨機引物的數量可以對任何複雜的生物變異進行基因分型. Napimoga等［6］對16例受試者的299株變形鏈球菌臨床分離株進行基因分型，在8例無齲受試者中分離出24種基因型，平均每個受試者1～4種基因型，而在8例高齲患者中分離出44種基因型，平均每個受試者2～8種基因型，表明在不同齲敏感者中，分離出的變形鏈球菌基因型具有多態性. Napimoga等［6］推測高齲患者高發齲的原因可能是由於其攜帶有某些特定類型的基因型菌株或頻繁進食酸性碳水化合物的結果，也可能是其定植的多種致齲基因型種類的變鏈菌菌株共同增加患齲風險的結果.

   

本研究顯示提取的變形鏈球菌染色體DNA模板的質量合格，可產生可靠、穩定的基因組指紋圖譜，且具有良好的重複性. 但是,變鏈菌除了進行單個基因相關性的研究外，還要綜合分析多基因的研究結果，才有可能揭示遺傳因子在齲病發生中的作用. 對變鏈菌的基因多態性進行深入研究，充分運用AP-PCR指紋技術的分型敏感性，對各基因型的變鏈菌與其它致齲作用進行對應研究，將對齲病的治療產生積極的影響.

 

作者：李偉，賀新蘭，胡紅梅，張錚輝，王蔚，周鵬，湯洪，劉興容  《第四軍醫大學學報》

  　　［1］ Korithoski B,Kraste lK,Cvitkovitch DG,et al. Transport and metabolism of citrate by Streptococcus mutans［J］. Bacteriology,2005,187(13):4451-4456.

　　［2］ Mattos-Graner RO,Li YH. Genotypic diversity of mutans treptococci in Brazilian nursery children suggests horizontal transmission［J］. Clin Microbiol,2001,39(6): 2313-2316.

　　［3］ Hamada S,Slade HD. Biology,immunology,and cariogenicity of Streptococcus mutans［J］. Microbiology,1980，44:331-384.

　　［4］de Soet JJ,Nyvad B,Kilian M. Strain-related acid production by oral streptococci［J］. Caries Res,2000,34(6): 486-490．

　　［5］ William JG,Kubelik AR,Livak KJ,et al. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers［J］. Nucleic Acids Res，1990,18(22):6531-6535.

　　［6］ Napimoga MH,Kamiya RU,Rosa RT,et al. Genotypic diversity and virulence traits of Streptococcus mutans in caries-free and caries-active individuals［J］. Med Microbiol,2004,53(Pt 7):697-703.

［7］黃曉晶,劉天佳,陳國弟,等. 變形鏈球菌（血清型C）臨床分離株AP-PCR基因分型［J］. 中華口腔醫學雜誌,2001,36(4):281-284.