產ESBLs大腸埃希菌的耐藥表型及水平傳播研究

【摘要】  目的了解昆明市第一人民醫院臨床分離的大腸埃希菌超廣譜β內酰胺酶(extended spectrum βlactamases，ESBLs)的耐藥表型和水平傳播情況。方法 對2005年1月～12月昆明市第一人民醫院臨床分離的197株大腸埃希菌用表型確證試驗檢測ESBLs，用KirbyBauer瓊脂擴散法做藥物敏感試驗；用接合試驗了解產ESBLs基因是否定位於質粒，並對接合子進行KB法藥敏試驗和ESBLs表型確證。結果 197株大腸埃希菌中共檢出產ESBLs菌104株，檢出率52.79%。在各類標本中產ESBLs菌株在纖維支氣管鏡(bronchofibroscope，BF)刷片中分離率最高(75%)，就科別來看內分泌科標本的產ESBLs大腸埃希菌的分離率最高(78.57%)。除亞胺培南和阿米卡星外，產ESBLs菌株對其他15種抗菌藥物的耐藥率明顯高於非產ESBLs菌株(P<0.01)。104株產ESBLs菌株中有91株符合供體菌的標準，64株接合成功，接合子均確證產ESBLs，其接合率為70.33%。64株供體菌及其相應接合子的藥敏結果顯示除複方磺胺甲口惡唑、左氧氟沙星、慶大黴素、頭孢吡肟和頭孢西丁外，供體菌及其接合子對其他12種藥物耐藥率無顯著性差異(P>0.05)。結論 昆明市第一人民醫院大腸埃希菌產ESBLs和耐藥質粒水平傳播情況嚴重，臨床應加強對大腸埃希菌耐藥性的監測，嚴格掌握抗生素的使用指征，防止耐藥菌株的傳播流行。

【關鍵詞】  大腸埃希菌；超廣譜β內酰胺酶； 耐藥； 接合實驗

     大腸埃希菌是臨床分離的革蘭陰性杆菌中最常見的菌種，它作為重要的條件致病菌廣泛存在於自然界，由於臨床廣譜抗生素特別是第三代頭孢菌素抗生素的大量使用，菌類在選擇性壓力下不斷發展其耐藥機製，產生超廣譜β內酰胺酶已成為重要的耐藥機製之一，給臨床治療帶來很大的困難。本研究收集2005年1月～12月我院臨床標本中分離的197株大腸埃希菌，通過表型確證試驗、藥物敏感試驗和接合試驗，了解本地區大腸埃希菌產ESBLs發生率、產ESBLs菌株的藥敏情況以及產ESBLs大腸埃希菌耐藥性在同種菌中的水平傳播情況，現報道如下。

    1  材料和方法

    1.1  菌株及鑒定

    收集2005年1月～12月昆明市第一人民醫院住院及門診感染患者送檢的各類標本中分離得到的大腸埃希菌197株，排除同一患者同一部位重複分離的菌株。其中來自尿液標本96株(48.73%)、痰液標本68株(34.51%)、血液標本11株(5.58%)、BF刷片8株(4.06%)、傷口分泌物5株(2.54%)、膿液3株(1.53%)、其它標本6株(3.05%)。標本來自呼吸科40例、門診29例、消化內科18例、重症監護室(ICU)17例、內分泌科14例、泌尿外科14例、幹部科12例、腫瘤科11例、中醫科9例、神經外科8例、兒科6例、神經內科4例、骨科2例、其他科室13例。全部菌株按照《全國臨床檢驗操作規程》第二版常規培養分離。菌株采用BD BBL Crystal ENF鑒定係統鑒定到種。

    1.2  質控菌株及受體菌

    質控菌為大腸埃希菌ATCC35922(敏感株)和大腸埃希菌ATCC35218(產β內酰胺酶株)。受體菌為利福平耐藥的大腸埃希菌C600(北京協和醫院檢驗科惠贈)。

    1.3  培養基、抗菌藥物紙片和試驗用藥

    法國BioMerieux公司MuellerHinton瓊脂；英國Oxoid生產的藥敏紙片， 分別為阿米卡星、 阿莫西林/克拉維酸、氨苄西林、氨苄西林/舒巴坦、氨曲南、複方磺胺甲口惡唑、左氧氟沙星、呱拉西林、慶大黴素、亞胺培南、頭孢吡肟、頭孢呋辛、頭孢曲鬆、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢西丁、頭孢唑林、頭孢噻肟/克拉維酸(CD03，30μg/10μg)、頭孢他啶/克拉維酸(CD02，30μg/10μg)，共19種。利福平(美國Sigma公司)、頭孢噻肟(德國Hoechst公司)。

    1.4  藥物敏感試驗

    采用KB紙片擴散法，藥敏結果均按照美國CLSI/NCCLS 2003年標準定義，以敏感(S)、中介(I)、耐藥(R)報告結果。

    1.5  ESBLs確證試驗

    參照CLSI/NCCLS M2A8(2003年版本)推薦的紙片確證擴散法標準進行，采用頭孢噻肟(30μg)，頭孢噻肟/克拉維酸(30μg/10μg)，頭孢他啶(30μg)，頭孢他啶/克拉維酸(30μg/10μg)紙片檢測，對兩組中任何一個藥物加克拉維酸的抑菌圈直徑與不加克拉維酸的抑菌圈直徑相比，差值≥5mm時，可確證該菌株產ESBLs。

    1.6  接合實驗

    利用分別含利福平、頭孢噻肟抗生素的MH平皿篩選供體菌共91株，受體菌為利福平耐藥的大腸埃希菌C600，接合完成後，用含有3mg/L頭孢噻肟和150mg/L利福平的MH平皿篩選接合子。篩選出的接合子作生化鑒定與大腸埃希菌C600生化特征一致，對接合子進行KB法藥敏試驗和ESBLs表型確證。

    1.7  結果分析

    文中的數據和表格采用WHONET5.3軟件及Excell進行分析。耐藥率比較采用SPSS11.0軟件進行χ2檢驗。

    2  結果

    2.1  ESBLs分離率

    2005年1月～12月臨床分離的大腸埃希菌共197株，其中104株產ESBLs，ESBLs分離率為52.79%。

    (1)產ESBLs菌株在不同標本中的分布  大腸埃希菌在中段尿標本中的分離株數最多(96株)，其次是痰(68株)和血液(11株)標本；產ESBLs株分別為47株(49%)、40株(58.8%)和3株(27.3%)。在BF刷片中分離率最高［8株中產ESBLs 6株(分離率75%)］，其次為膿液［3株中產ESBLs 2株(66.7%)］和傷口分泌物［5株產ESBLs 3株(6%)］。

(2)產ESBLs菌株在不同病區的分布  大腸埃希菌在呼吸科的分離株數最多(40株，其中產ESBLs 20株)，其次為門診(29株，產ESBLs 13株)和內分泌病房(14株，產ESBLs 11株)。內分泌科產ESBLs大腸埃希菌的發生率最高，其次為神經外科和幹部病房。

    (3)產ESBLs菌株與非產ESBLs菌株耐藥率比較  兩種菌株除對亞胺培南和阿米卡星耐藥率的差異無統計學意義(其中兩者對亞胺培南的敏感率均為100%)外，產ESBLs菌株對其他15種抗菌藥物的耐藥率明顯高於非產ESBLs菌株(P<0.01)，其中非產ESBLs菌株對頭孢曲鬆、頭孢他啶、氨曲南和頭孢吡肟的敏感率為100%，產ESBLs菌株對四種藥物的敏感率隻有15.4%～84.6%。ESBLs陽性菌株與ESBLs陰性菌株對17種抗菌藥物的耐藥率比較如表1所示。 表1    產ESBLs菌與非產ESBLs菌耐藥率比較

    2.2  接合實驗

    104株產ESBLs菌株中有91株對利福平敏感並對其做接合試驗，結果有64株接合成功，接合子的生化特征與受體菌大腸埃希菌C600完全一致，64株接合子均確證產ESBLs，其接合率為70.33%。64株供體菌及其相應接合子的藥敏結果顯示除複方磺胺甲口惡唑、左氧氟沙星、慶大黴素、頭孢吡肟和頭孢西丁外，供體菌及其接合子對其他12種藥物耐藥率的差異無統計學意義(P>0.05)，兩者對氨苄西林、呱拉西林、頭孢唑林和頭孢呋辛的耐藥率均為100%，對亞胺培南的敏感率均為100%。

    3  討論

    在美國，腸杆菌科細菌ESBLs的平均檢出率為3%，不同醫院的檢出率波動在0～25%；埃及腸杆菌科細菌ESBLs的發生率達到60.9%；土耳其大腸埃希菌的ESBLs發生率為12%［1，2。在中國大陸，不同醫院之間有明顯差異，如上海2000年4家醫院聯合監測結果顯示大腸埃希菌中的ESBLs發生率為30.21%［3］；王輝等對2003～2004年中國10家教學醫院革蘭陰性杆菌的耐藥分析結果顯示大腸埃希菌ESBLs發生率為56.8%［4］；2002年浙江省大腸埃希菌中的ESBLs發生率為36.3%［5］；2002年廣東大腸埃希菌中的ESBLs發生率為28.1%［6］。同一醫院不同時期ESBLs的發生率也有差別，如複旦大學附屬上海市第五人民醫院從1999～2002年大腸埃希菌中的ESBLs發生率分別為21.5%、17.7%、22.6%和32.4%，有逐年升高的趨勢［7］；我院2002年、2003年、2004年1～6月大腸埃希菌ESBLs發生率分別為37.1%、45.8%和66.2%［8］，本研究結果示2005年1月～12月我院大腸埃希菌ESBLs發生率為52.79%，較2004年1～6月有所下降，可能與我院加強ESBLs的監測和合理使用第三代頭孢菌素有一定的關係，但ESBLs發生率仍處於較高水平，因此臨床上應繼續嚴格掌握和使用第三代頭孢菌素，以減輕抗菌藥物的選擇性壓力，防止產ESBLs菌株的產生和流行。

    本文藥敏試驗敏結果顯示ESBLs菌株對亞胺培南、阿米卡星的耐藥率分別為0、7.69%，因此我院暫時將此兩藥作為臨床經驗用藥。

    ESBLs基因定位於質粒，由於質粒可以通過接合由供體菌轉至受體菌，通過接合試驗確證91株對利福平敏感的大腸埃希菌的ESBLs基因定位於質粒，了解產ESBLs大腸埃希菌在同種菌株之間的水平傳播情況。本研究提示我院大腸埃希菌臨床分離株對複方磺胺甲口惡唑、慶大黴素、頭孢吡肟和頭孢西丁的耐藥性有一部分是通過質粒介導的，但主要是通過染色體或其他耐藥機製介導的。大多數資料表明喹諾酮類藥物的耐藥性是僅通過染色體介導的［9］，但近年來有許多報道認為喹諾酮類藥物的耐藥性也可以通過質粒傳播［10］，從我院大腸埃希菌臨床分離株的接合試驗藥敏結果來看，喹諾酮類藥物耐藥性有一部分是通過質粒介導的，但主要是通過染色體介導。

總之，大腸埃希菌產ESBLs發生率和水平傳播率很高，且大腸埃希菌在不同標本、不同科室的分離率和耐藥性有較大差異，因此在臨床治療時，應根據藥敏結果選用合理的抗生素，延緩耐藥株的產生。

 

作者： 趙曉麗 胡大春 周玲 劉德華 蔣傑《中國抗生素雜誌》

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