ICU分離銅綠假單胞菌耐藥性分析

 銅綠假單胞菌是臨床最常見的條件致病菌之一,已對臨床感染的控製構成嚴重威脅［１～３］。現就本院ICU近三年來分離的銅綠假單胞菌耐藥性進行研究分析。

　　1 資料與方法

　　1.1  菌株   

　　收集2002年6月至2005年6月ICU住院患者分離的銅綠假單胞菌67株，細菌來源包括痰液58株，咽拭子7株，留置導尿2株。

　　1.2 主要試劑   

　　2-巰基丙酸（2-MPA）購自Sigma公司。抗菌藥紙片：氨苄西林/舒巴坦，替卡西林，替卡西林/克拉維酸，呱拉西林，呱拉西林/他唑巴坦，頭孢呱酮，頭孢呱酮/舒巴坦，頭孢吡肟，頭孢他啶，阿米卡星，環丙沙星和複方新諾明，均為英國 Oxoid公司產品。

　　1.3  方法   

　　采用Kirby-Bauer瓊脂擴散法，結果按NCCL 2005年版判斷［４］。質控菌株為銅綠假單細胞ATCC 27853。

　　1.4  金屬β內酰胺酶（金屬酶）測定   

　　采用2-巰基丙酸（2-MPA）協同試驗方法［５］，在預告已塗布待檢菌MH平板上分別貼上2-MPA紙片和頭孢他啶紙片，兩紙片中心間距30mm，過夜培養後觀察結果，凡頭孢他啶片抑菌環擴大者即判為產金屬酶陽性。

　　1.5  金屬酶和外膜蛋白分析   

　　用PCR方法分別檢測金屬酶IMP型和VIM型和外膜蛋白D2（oprD2）。靶基因引物序列（5'→3'）IMP型為CTACCGCAGCAGAGTCTTTC和AACCGTTTTGCCTTACCAT；VIM型為ATTCCGGTCGG（A/G）GAGGTCCG和GAGCAAGTCTAGACCGCCCG；oprD2為GCGCATCTCCAAGACCATG和GCCACGCCATTTGACGGAG。堿裂解法提取DNA模析，按說明書設置各PCR反應體係和熱循環參數，PCR擴增儀為PE 9600型。擴增產物作2%瓊脂糖凝膠電泳，PCR檢測陽性對照DNA(以上試劑盒及對照物均由無錫克隆遺傳所提供)。

　　2  結果

　　2.1  金屬酶檢出結果   

　　檢出產金屬酶菌28株（41.8%），分別為痰液25株，咽拭子3株。基因檢測23例陽性，其中IMP型17株，VIM型6株，型別不明5株。  檢測有32株缺失。

　　2.2 藥敏試驗結果   

　　見表1。表1  67株銅綠假單胞菌對13種抗生素耐藥率（略）

　　3 討論

    銅綠假單胞菌的耐藥機製主要有外膜蛋白D2丟失和產生β內酰胺酶，其中產生金屬酶可導致幾乎對所有的β內酰胺類抗生素耐藥，且酶抑製劑的抑製作用很弱［６］。本研究結果，在67株細胞中用2-MPA協同試驗有28株為產金屬酶株；基因檢測有23株陽性，目前已知的金屬酶基因型有IMP、VIM、L1、OXA、GES、2TFFU等［７］，是否還有其它基因型別尚有待研究。值得關注的是2003年和2004年的菌株基因型以IMP為主，隨後演變為以VIM為主，總共有32株細菌證明蛋白D2   缺失，其中產金屬酶的菌株均為缺失，表明外膜通道不暢也是導致細菌耐藥的主要原因之一。

近年來，銅綠假單胞菌對β內酰胺類抗菌藥物的耐藥率已有上升趨勢，尤其是產金屬酶的菌株。對13種常用藥物的檢測結果表明，產金屬酶菌株除對替卡西林、亞胺培南全部耐藥外，對氨苄西林/舒巴坦、複方新諾明、呱拉西林、頭孢他啶、頭孢呱酮、替卡西林/克拉維酸、呱拉西林/他唑巴坦和環丙沙星的耐藥率也在50%～93%之間。耐藥率＜50%的僅有阿米卡星、頭孢呱酮/舒巴坦和頭孢吡肟，與文獻相近［１，２，８］。按照對亞胺培南、頭孢他啶、呱拉西林、環丙沙星等均耐藥的銅綠假單胞菌定義為多藥耐藥銅綠假單胞菌（MDRP）［９］，28株產金屬酶菌株大多還對複方新諾明和環丙沙星耐藥，屬於MDRP。對於產金屬酶細菌的治療，目前尚無應用於臨床的金屬酶抑製劑，氨曲南不被金屬酶所水解，但臨床應用的效果並不理想，頭孢呱酮/舒巴坦、呱拉西林/他唑巴坦顯示有較好的敏感性，必要時，可與氨基糖苷類或氟諾酮類聯合使用。

 

作者：陳燕青 趙仲農 錢小毛《浙江臨床醫學》　

【參考文獻】

  　　1 周立新,張秀平,方濱,等. 重症監護病房感染患者銅綠假單胞菌的分離與耐藥性分析. 中華醫院感染學雜誌,2004,14(7):807～808.

　　2 王輝,陳民鈞. 1994～2001年中國重症監護病房非發酵糖細菌的耐藥變遷. 中華醫學雜誌,2003,83(5):385～390.

　　3 蔣曉飛,洪秀華,孫景勇,等. 多重耐藥銅綠假單胞菌超廣譜β內酰胺酶分析. 中華微生物學和免疫學雜誌,2002,22(6):443～446.

　　4 Nccls. Perfomation sandards of antimicrobial susceptibility testing:Fifteenth informational supplement. M100-S15. National Committee for Clinical Laboratry Standards,2005,25(1):40～42.

　　5 錢小毛，毛中萍，趙仲農，等. 2-巰基丙酸協同試驗檢測細菌金屬β內酰胺. 中華檢驗醫學雜誌,2004,27(2):126.

　　6 趙青,魏澤慶,俞雲鬆,等. 重症監護病房產VIM-2型金屬酶銅綠膿假單胞菌的研究. 中華檢驗醫學雜誌,2004,27(10):678～682.

　　7 糜祖煌. 金屬β內酰胺酸基因及其檢測方法. 現代實用醫學,2004,16(1):15～16.

　　8 辜依海,羅燕萍,張文莉,等. 耐亞胺培南銅綠假單胞菌的耐藥性分析及金屬內酰胺酶檢測. 中華醫學感染學雜誌,2005,15(3):339～341.

　　9 王輝;陳民鈞. 非發酵革蘭陰性杆菌的耐藥發展研究進展. 中國抗生素雜誌,2004,29(3):193～195.