注射用鹽酸索他洛爾無菌檢查的方法驗證

【摘要】  目的：建立注射用鹽酸索他洛爾的最佳無菌檢查方法，保證檢驗結果的準確和可靠性。方法：按中國藥典2005年版二部（附錄Ⅺ H）無菌檢查法中的薄膜過濾法進行。結果：樣品管無菌生長，六株陽性對照菌生長良好。結論：方法學驗證采用薄膜過濾法進行的無菌檢查，可行。

【關鍵詞】  注射用鹽酸索他洛爾無菌檢查法（薄膜過濾法） 方法學驗證

　　無菌檢查時必須選擇適宜的方法消除其抗菌作用，才能保證檢驗結果的準確和可靠性。為此我們按照《中國藥典》2005年版二部（附錄Ⅺ H）無菌檢查法項下薄膜過濾法的要求對注射用鹽酸索他洛爾進行了實驗，對其無菌檢查方法進行了驗證。

　　1  儀器與材料

　　1.1  儀器  HTY-2000A型智能集菌儀及全封閉式無菌過濾培養器（杭州高得醫療器械有限公司）。

　　1.2  供試品  注射用鹽酸索他洛爾（吉林市卓怡康納製藥有限公司，規格40mg/支，批號為060201）。

　　1.3  培養基及衝洗液  硫乙醇酸鹽流體培養基（批號：050907）、改良馬丁培養基（批號：060419）、營養肉湯培養基（批號：050919）、營養瓊脂培養基（批號：060330）、PH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液（批號：0604242），均由北京三藥科技開發公司提供。

　　1.4  驗證試驗用菌種  ①金黃色葡萄球菌[CMCC（B）26 003]；②銅綠假單胞菌[CMCC（B）10 104]；③枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63 501]；④生孢梭菌[CMCC（B）64 941]；⑤白色念珠菌[CMCC（F）98 001]；⑥黑曲黴[CMCC（F）98 003]；以上菌種均由中國藥品生物製品檢定所提供。

　　2  方法與結果

　　按中國藥典2005年版二部無菌檢查法（附錄Ⅺ H）方法驗證進行試驗。

　　2.1  菌液製備

　　2.1.1  取經36℃培養20h的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢杆菌的肉湯新鮮培養物1ml加入0.9%的無菌氯化鈉溶液9ml，10倍稀釋至10－6約為50～100cfu/ml，備用。

　　2.1.2  取經36℃培養20h的生孢梭菌硫乙醇酸鹽流體培養物1ml，加入0.9%的無菌氯化鈉溶液9ml，10倍稀釋至10－6約為50～100cfu/ml，備用。

　　2.1.3  取經26℃培養48h的白色念珠菌改良馬丁液體培養物1ml，加入0.9%的無菌氯化鈉溶液9ml，10倍稀釋至10－6約為50～100cfu/ml，備用。

　　2.1.4  取經26℃培養1周的黑曲黴斜麵培養物，加0.9%的無菌氯化鈉溶液10ml，將孢子洗脫後，吸出孢子懸液，用墊有脫脂棉的漏鬥（濕熱滅菌）過濾，除去菌絲，收集菌液至另一無菌試管內作為原液。取此原液0.1ml，加0.9%無菌氯化鈉溶液9.9ml，稀釋至10－5約為50～100cfu/ml，備用。

2.2  菌液計數

　　每種菌液接種2個平皿，取其平均值。取金黃色葡萄球菌液、銅綠假單胞菌液、枯草芽孢杆菌液、生孢梭菌液各1ml注入約15ml營養瓊脂平皿，36℃培養，白色念珠菌、黑曲黴菌菌液各1ml注入約15ml改良馬丁培養基26℃培養，計數，結果見表1。

　　表1  驗證用菌液的稀釋度及接種量（略）

　　3  驗證方法的選擇

　　3.1  方法驗證試驗1

　　取一次性全封閉式無菌過濾培養器（兩聯）一套，在一管中先泵入培養基並夾緊管口，再將10瓶供試品按薄膜過濾法濾至另一管並泵入相同培養基，於兩管中分別接入小於100cfu的試驗菌。前者作為陽性對照管，陰性對照管即分別將硫乙醇酸鹽流體培養基及改良馬丁培養基泵入另兩管培養器中培養，按規定溫度將上述培養器培養3～5天，各試驗菌同法操作，見表2。

　　表2  方法驗證試驗1：試驗組與陽性對照組檢驗結果（略）

　　注：對照組：菌液＋培養基；試驗組：供試品＋菌液＋培養基；陰性對照組：硫乙醇酸鹽流體培養基及改良馬丁培養基。

　　3.2  方法驗證試驗2

　　取一次性全封閉式無菌過濾培養器（兩聯）一套，在一管中先泵入培養基並夾緊管口，將10瓶供試品按薄膜過濾法濾至另一管，用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液分3次衝洗，每次200ml，泵入相同培養基，於兩管中分別接入小於100cfu的試驗菌。前者作為陽性對照管，陰性對照管即分別將硫乙醇酸鹽流體培養基及改良馬丁培養基泵入另兩管培養器中培養，按規定溫度將上述培養器培養3～5天，各試驗菌同法操作。結果六株陽性對照菌正常生長，見表3。

　　表3  方法驗證試驗2：試驗組與陽性對照組檢驗結果（略）

　　4  樣品的無菌檢查

　　取本品30瓶按薄膜過濾法濾至一次性全封閉式無菌過濾培養器（三聯）中，用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液分3次衝洗，每次200ml，2管加入硫乙醇酸鹽流體培養基（其中1管接入小於100cfu的金黃色葡萄球菌作為陽性對照管），第3管加入改良馬丁培養基，按規定溫度培養14天，逐日觀察，供試品管均澄清，陽性對照管生長良好，供試品符合規定。

　　5  討論

無菌檢查的目的既要保證標準規定的所有陽性對照菌正常生長，又要準確無誤的檢查樣品染菌情況，所以對其進行驗證是十分必要的。在藥品的無菌檢查中，需要用衝洗液進行衝洗的品種不能簡單的按藥品的用途來分類，還包括精神類藥品及抗病毒類藥品等。注射用鹽酸索他洛爾是化學類藥品，方法驗證試驗1沒有進行衝洗的薄膜過濾法，結果在該條件下對生孢梭菌有抑菌作用。方法驗證試驗2用PH7.0無菌氯化鈉-蛋白腖緩衝液衝洗後才消除其抑菌成分，故可作為注射用鹽酸索他洛爾的無菌檢查法。

 

作者：李立冬 費麗娜《中國醫學雜誌》