比濁法快速測定硫酸多黏菌素E效價

【摘要】  研究比濁法測定硫酸多黏菌素E效價的影響因素和規律，建立了硫酸多黏菌素E的比濁法快速測定方法，檢測時間由杯碟法的20h縮短到4h。當硫酸多黏菌素E的效價為30～100u/ml時，檢測菌液接種濃度為5%，培養時間為4h，吸光度對數值與抗生素效價具有良好的線性關係。本法重現性好，相對誤差小於5%。

【關鍵詞】  硫酸多黏菌素E 比濁法 效價

    Fast determination of the potency of polymyxin E by turbidimetry assay

    ABSTRACT  A turbidimetry assay for fast determination of polymyxin E potency was developed by studying on the influencing factors. Compared with Oxford assay, turbidimetry assay decreased the determination time from 20 hours to 4 hours. There was a linear relationship between the potency of polymyxin E and the logarithm of absorbency in the range of 30～100u/ml and inoculating concentration was 5%, with 4hour culture time. The turbidimetry assay had a good reproducibility, and the relative error was less than 5%.

    KEY WORDS  Polymyxin E;  Turbidimetry assay;  Potency

     多黏菌素E(polymyxin E或colistin)是由多黏芽孢杆菌抗敵素變株(Bacillus polymyxin var.colistinus)經發酵培養生產的一種環狀多肽類抗生素，它對革蘭陰性杆菌有強烈的抑菌作用［1］。由於多黏菌素E具有高效、低毒、殘留少的特性，將其硫酸鹽製成獸藥用於防治由大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、沙門菌等革蘭陰性菌［2］引起的肉雞、豬、牛等畜禽的腸道疾病。目前采用杯碟法［3，4］測定其生物效價。杯碟法操作步驟複雜，耗時長，測定時間需要大約20h，不能快速反饋工業生產中各個階段產品生物活性，必須開發一種快速測定硫酸多黏菌素E效價的方法。比濁法是抗生素效價微生物檢定的方法之一［5～8］，其原理是將一定量的抗生素加至接種有試驗微生物的液體培養基內，混勻後，經短期培養，測量培養物的吸光度，在一定線性範圍內細菌培養物吸光度的對數值logA與抗生素的濃度成正比，比濁法具有檢測快速的特點。本文深入研究了比濁法測定硫酸多黏菌素E效價的影響因素和規律，建立了硫酸多黏菌素E的比濁法快速檢測方法。

    1  材料與方法

    1.1  材料

    (1)檢定菌  大腸埃希菌(CMCC(B)44102)購自微生物菌種保藏中心。

    (2)硫酸黏杆菌E素(硫酸多黏菌素E)標準品  中國獸醫藥品監查所提供，批號K02700902，效價19536u/mg。

    (3)主要儀器  752紫外分光光度計；恒溫水浴振蕩器；牛津杯(不鏽鋼，高100mm，外徑8.0mm，內徑6.0mm)；PHS3C精密pH計。

    1.2  方法

    (1)檢定培養基的製備  稱取蛋白腖8g，牛肉膏4g，酵母粉5g，磷酸氫二鉀3.3g，磷酸二氫鉀1g，氯化鈉4.5g，葡萄糖2.5g，加蒸餾水至1000ml加熱混勻，調節pH值為7.2，過濾，115℃滅菌30min。

    (2)檢測菌液的製備  取大腸埃希菌的瓊脂斜麵培養物一支，加0.9%滅菌生理鹽水1ml洗下菌苔轉入茄瓶，37℃培養18～22h，用0.9%滅菌生理鹽水15ml洗下菌苔，製成菌液，在分光光度計上波長為600nm處用0.9%滅菌生理鹽水調節菌液吸光度值(A=2左右)，用此菌液分以2.5%、5%和10%的接種量接種至檢定培養基作為檢測菌液。

    (3)硫酸多黏菌素E標準溶液的配製  精確稱取硫酸多黏菌素E標準品，用pH6.0的磷酸鹽緩衝液稀釋到600u/ml，再用水稀釋成濃度分別為30、40、50、60、70、80、90和100u/ml等8種濃度的標準溶液。

    (4)比濁法吸光度測定  精密吸取1ml硫酸多黏菌素E溶液，加9ml檢測菌液，放入恒溫水浴搖床以200r/min轉速37℃振蕩培養一定時間，取出，立即用冷水冷卻，搖勻，以9ml未接種檢定培養基和1ml水混合液作參比，用分光光度計在600nm波長處［9］分別測定吸光度。

    (5)比濁法樣品檢測  將樣品稀釋到適當濃度後，按實驗1.2.(4)中有關步驟操作測定吸光度，在吸光度對數效價標準曲線上查對應的效價，乘以稀釋倍數，即得到樣品的效價。

    2  結果與討論

    2.1  檢測條件的選擇

    (1)大腸埃希菌生長曲線的測定  將大腸埃希菌菌液分別以2.5%、5.0%和10%的接種量接入檢定培養基，37℃條件下以200r/min振蕩培養，在600nm處每小時檢測一次培養物的吸光度，結果如Fig.1所示。大腸埃希菌在自然狀態下生長時延遲期一般為1h左右，這一時期菌體生長緩慢，菌量基本上維持在最低水平；然後進入指數期，這一時期大約持續7～8h，這一時期菌體生長速率常數最大，生長最迅速；9h以後進入穩定期，菌體總量保持不變。當菌體生長時間在2～4h，吸光度值達到0.4～1.0，處於最佳檢測時期。

    Innoculating concentration: 1: 2.5%;  2: 5%;  3: 10%

    Fig.1    Cell growth curve of E.coli    (2)檢測菌液接種濃度的選擇  將接種濃度分別為2.5%、5.0%和10%的檢測菌液按實驗1.2.(4)培養2h，繪製吸光度效價曲線(Fig.2)。 由Fig.2可見，不同接種濃度的檢測菌液對培養物的吸光度影響較大。當檢測菌液接種濃度為2.5%時，由於初始接種量少，少量抗生素的存在能夠完全抑製菌體的生長，菌體幾乎不能生長；當檢測菌液接種濃度為10%時，菌體生長很快，抗生素難以抑製菌體生長，不同濃度抗生素對菌體生長的抑製程度不明顯；當檢測菌液接種濃度為5%時，不同濃度抗生素對菌體生長的抑製程度區別明顯，靈敏度高，因此5%接種濃度的檢測菌液適合本法測定硫酸多黏菌素E效價。

    Innoculating concentration: 1: 2.5%;  2: 5%;  3: 10%

    Fig.2    Effect of different innoculating concentration

    on absorbency

    (3)培養時間的選擇  接種濃度5.0%的檢測菌液，按實驗1.2.(4)分別培養2、3和4h，繪製吸光度效價曲線(Fig.3)。由Fig.3可見，在實驗菌接種量固定在5%的條件下，增加培養時間，靈敏度提高顯著。培養時間為2h，吸光度效價曲線比較平坦，靈敏度低，當培養時間增加為4h，不同濃度抗生素對菌體生長的抑製程度區別明顯，靈敏度高，因此選擇4h作為培養時間用於檢測。

2.2  標準曲線的確立

    精密吸取30、40、50、60、70、80、90和100u/ml等8種硫酸多黏菌素E標準溶液各1ml，加9ml接種濃度為5%的檢測菌液，放入恒溫水浴搖床以轉速200r/min 37℃培養4h，取出，立即用冷水冷卻，搖勻，以9ml未接種檢定培養基和1ml水混合液作參比，用分光光度計在600nm波長處分別測定吸光度，以硫酸多黏菌素E濃度為橫坐標，吸光度對數值為縱坐標，繪製標準曲線(Fig.4)。

    將吸光度對數值對相應濃度進行線性回歸，得到回歸方程：

    lgA=-0.01039C+0.1837  r=0.9953

    可見硫酸多黏菌素E的濃度在30～100u/ml的範圍內與吸光度對數值呈良好的線性關係。

    2.3  重現性測定

    用比濁法對3個不同規格的硫酸多黏菌素E樣品進行重現性試驗，檢測4次結果見Tab.1，相對標準偏差在3%以內，重現性較好。

    2.4  正確性測定

    以杯碟法［10］測定效價數據為標準，得出本方法的準確度(Tab.2)；比濁法測定的相對誤差在5%以內，符合藥典規定要求，提示比濁法能夠準確測定硫酸多黏菌素E效價。

    3  結論

    (1)比濁法能夠快速、準確地測定硫酸多黏菌素E效價，檢測時間由杯碟法的20h縮短到4h，方法重現性好，相對誤差小於5%。

    (2)比濁法進行硫酸多黏菌素E效價測定時應注意培養基的質量以及檢測儀器等。培養基配置後應過濾後再滅菌，以免培養基中形成沉澱影響測量。試管應選同一批、同一型號，管壁均勻一致，試管潔淨無汙染，以免影響測量結果。培養結束後立即冷卻，測定前應搖勻。

 

 作者：佟斌 吳兆亮 殷昊 趙豔麗 《中國抗生素雜誌》

【參考文獻】

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［3］ 吳佩玲. 改進硫酸粘杆菌素含量測定方法的介紹［J］. 中國獸藥雜誌，1990，3：22

［4］ 張純平，肖希龍. 硫酸粘杆菌素微生物檢定法的改進［J］. 中國獸藥雜誌，2002，36(4)：33

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［8］ 朱會琴，逢渙歡，胡昌勤，等. 濁度法測定兩性黴素B及其脂質體的效價［J］. 中國抗生素雜誌，2005，30(12)：752

［9］ 沈萍，範秀容，李廣武. 微生物學實驗(第三版)［M］. 北京：高等教育出版社，1999：97

［10］ 國家藥典委員會. 中華人民共和國藥典2005年版(二部)［S］. 北京：化學工業出版社，2005：附錄XIA