中藥對廣州地區流感嗜血杆菌抑菌作用研究

［摘要］ 目的：探討中草藥對廣州地區流感嗜血杆菌的體外抑菌作用。方法：采用瓊脂稀釋法檢測流感嗜血杆菌對中藥的最低抑菌濃度。結果：6種中草藥水煎劑均有不同程度的抑菌作用，其中黃連抑菌效果最好，黃連水煎劑對流感嗜血杆菌MIC50為1 g/L，MIC90為2 g/L。結論:中藥對流感嗜血杆菌有不同程度抑菌作用。

　　［關鍵詞］ 中草藥；抑菌作用；流感嗜血杆菌

　　Experimental Research on Antibacterial Effect of Chinese Herbal Medicines on Haemophilus Influenzae in Guangzhou

　　Abstract:Objective To explore the antibacterial effect of Chinese herbal medicines on Haemophflus influenzae in Guangzhou．Methods Minimal inhibitory concentratiOn(MIC) of the extracts affecting on bacteria was assayed by agar dilution．Results Six kinds of herbs decoction had different antibacterial effects on Haemophilus influenzae，among which Coptis washighly active against Haemophilus influenzae.Its MIC50 was 1 g/L.Conlusion Some chinses herbs had bacterionstatic effect against Haemophilus.

　　Key words:Chinses herbs;Bacteriostasis;Haemophilus influenzae

    流感嗜血杆菌是引起社區獲得性肺炎最常見致病菌之一，近年來在臨床檢出率不斷增多；流感嗜血杆菌在發展中國家小兒急性下呼吸道感染中分離率高達45％。世界各國發現流感嗜血杆菌耐藥菌株特別是β內酰胺酶陽性的耐氨苄西林菌株的報道日益增多［1，2］，給臨床治療帶來極大的困難。由於耐藥菌株的大量出現可導致臨床治療失敗，感染複發，住院時間延長，增加患者的經濟負擔和生理壓力。中藥具有清熱解毒、滋補、抗菌等作用，且具有副作用小、抗耐藥性好等特點，開始得到人們的廣泛關注。為此，本課題進行了中藥對本地區臨床分離的流感嗜血杆菌體外抑菌效果的研究，為臨床預防感染、臨床治療用藥提供依據。

　　1  材料與方法

　　1.1  菌株來源  2004年7月至2004年12月廣州地區5家醫院(廣州市第一人民醫院、廣州市兒童醫院、中山大學附屬第二醫院、廣州醫學院附屬第一、第二醫院)從臨床分離的156株流感嗜血杆菌，按常規鑒定方法［3］：將痰及咽拭子標本按常規方法接種在血瓊脂和巧克力平板上，35 ℃ 5％CO2環境下培養過夜，挑選2個~4個可疑菌落至血平板及胰大豆平板上作衛星試驗。並在另一胰大豆平板上貼X+V因子、X因子、V因子紙片，各紙片相距5 cm。隻在血平皿上衛星試驗陽性、在胰大豆平板上衛星試驗陰性，以及隻在X+V因子紙片周圍生長、X因子、V因子紙片周圍不生長的菌落可判定為流感嗜血杆菌。

　　1.2  中草藥  黃連、黃柏、黃芩、連翹、千裏光和金銀花共6種中藥，均由我院購自廣州市藥材公司。

　　1.3  抗生素紙片  氨苄西林、紅黴素、複方甲基異  唑、氯黴素、環丙沙星、阿莫西林／克拉維酸、頭孢呋新和頭孢噻肟均為英國OXOID公司產品。

　　1.4  培養基  HTM藥敏培養基和添加劑為英國OXOID公司產品。

　　1.5  中藥煎製  參照陳奇的方法［4］進行，將100 g中藥於砂鍋，加200 ml蒸餾水浸泡30 min後用慢火煎至水量濃縮為100 ml過濾，藥渣再加水200 ml煎煮、過濾，將2次濾液共200 ml煎煮濃縮成100 ml，使中藥濃度為1 g／ml。經高壓蒸汽滅菌後備用。中藥的最低抑菌濃度(MIC)的測定：按NCCLS推薦的瓊脂稀釋法測定實驗菌株的MIC值，用流感嗜血杆菌ATCC49619作參考質控菌株。

　　製備中藥瓊脂平板，中藥和HTM藥敏培養基瓊脂按比例混合，最終含藥濃度為250．0 g／L、125．0 g／L、62．5 g／L、31．25 g／L、15．62 g／L、7．81 g／L、3．90 g／L、1．95 g／L、0．98 g／L。

　　製備菌液，菌液調整為0．5麥氏單位後再作1∶10稀釋，用1 μl定量接種環點種於瓊脂表麵，最終瓊脂上所含接種菌量為104 cfu／ml。

　　采用多點接種法，首先點種生長對照平板(不含中藥)，隨後從最低濃度開始，依次點種不同濃度的中藥平板，放35 ℃孵育24 h，記錄無菌生長的最低中藥濃度。

　　1.6  抗生素敏感試驗  采用KB法進行，操作和結果判斷嚴格按照NCCLS製定的最新規則及標準進行;用標準菌株ATCC49247作為質量控製。

　　1.7  數據統計分析  用WHO提供的WHONET5．3軟件統計，分析MIC50及MIC90的中藥濃度和抗生素的敏感試驗。

　　2  結果

　　2.1  抗生素的敏感試驗  156株流感嗜血杆菌中β內酰胺酶陽性的占25％，除頭孢噻肟外，對抗生素均出現不同程度的耐藥，其中對複方甲基異  唑耐藥率最高，達53．4％，其次為環丙沙星、氨苄西林、氯黴素，詳見表1。

　　2.2  抑菌作用  6種中藥對156株小兒流感嗜血杆菌均有不同程度的抑菌作用，其中黃連抑菌效果最好，黃連水煎劑對流感嗜血杆菌MIC50為1 g/L，MIC90為2 g/L;黃芩、黃柏、金銀花和千裏光水煎劑對流感嗜血杆菌MIC50分別為2 g/L、4 g/L、4 g/L、2 g/L、2 g/L，MIG90分別為4 g/L、16 g/L、16 g/L、8 g/L、8 g/L。

表1  常用抗生素對流感嗜血杆菌的藥敏結果(略)

　　3  討論

　　流感嗜血杆菌是引起肺炎、中耳炎、敗血症和腦膜炎的常見病原菌，在兒科病例中尤為常見，是兒童呼吸係統感染主要病原菌之一，被認為是學齡前兒童中繼肺炎鏈球菌後造成急性中耳炎的第二種病原菌。氨苄西林於20世紀70年代初期取代氯黴素和四環素成為治療流感嗜血杆菌感染的首選藥物，1974年首次分離出產TEM1型β內酰胺酶的氨苄西林耐藥菌株。目前氨苄西林耐藥菌株遍及全球。美國及歐洲國家，自20世紀70年代中期至80年代中期流感嗜血杆菌耐藥呈上升趨勢，20世紀80年代後期和20世紀90年代初則上升減慢。亞洲國家和地區同樣存在流感嗜血杆菌的流行，菲律賓氨苄西林耐藥率為6．3％，韓國為9％，泰國為14．6％，香港20％，而台灣高達35．7％。本組氨苄西林耐藥率為20．5％，較歐美國家的耐藥率高，卻比台灣要低，這可能與廣州地區對氨苄西林的口服製劑應用頻度較高有關。隨著抗生素廣泛使用，細菌耐藥性已成為全球所關注的焦點，尤其是近幾年來一些條件致病菌如流感嗜血杆菌能引起原發性化膿感染及嚴重繼發感染。自1974年在歐洲報道首例耐氨苄西林的流感嗜血杆菌菌株以來，越來越多的耐藥菌株在世界上報道，由於耐藥菌株的大量出現可導致臨床治療失敗患者感染複發，住院時間延長，大大增加了患者及社會的負擔。由於中藥的抑菌作用不同於抗生素，因此日益受到臨床重視，本實驗從藥效學角度比較了黃連、黃芩等6種不同清熱解毒中藥水煎液對流感嗜血杆菌抑菌作用，結果各種中藥均有不同程度的抑菌作用，抑菌效果最好是黃連，其次是黃芩、金銀花和千裏光；連翹抑菌效果相對較弱，黃連水煎劑的MIC50隻有1 g/L。

　　中藥的抑菌機製尚不清楚，有報道通過對中藥與抗生素作用後菌落直徑大小的比較，提示了中藥成分可能具有與一般抗生素不同的抑菌機製［5］，流感嗜血杆菌對β內酰胺類抗生素耐藥是由於細菌產生青黴素酶，對四環素的耐藥機製主要為獲得外源性DNA編碼產生四環素泵出係統，或產生具有核蛋白體保護作用的蛋白質，也可以因為染色體突變導致外膜滲透性降低。對四環素的耐藥性通常係質粒介導，含tetB基因的流感嗜血杆菌含能量依賴泵出係統，可在四環素到達靶位核糖體前將其泵出［6］。而中藥抑菌成分較多，可作用於細菌的不同部位和繁殖的不同階段，並對細菌的多個代謝環節作用，故不易產生耐藥性。

　　清熱解毒藥物不僅具有抑菌作用，並且能通過調節機體的整體免疫反應和改變機體的局部微環境條件，從而達到清除病原菌，提高臨床療效的目的。本次研究采用的是體外抑菌實驗，在體內能否達到抑菌濃度，控製感染，有待繼續探討。本試驗用於中藥的最低抑菌濃度(MIC)測定采用NCCLS推薦的瓊脂稀釋法，該法是測定抗生素敏感性的一門成熟的技術，但是中藥濃度不好控製，濃度增大時瓊脂難以凝固，藥物濃度太低，又達不到中藥的抑菌濃度，也有待繼續探討完善檢測方法。

中藥藥源廣泛、價格低廉，具有廣闊開發潛力。因此積極探討中藥的抑菌作用，以指導臨床合理使用中藥協同抗生素治療細菌感染，對減少細菌耐藥性的產生有著積極的意義。

 

作者：葉惠芬，劉平，陳惠玲，李尚文《實用醫技雜誌》

　　參考文獻：

　　［1］  盛朝凱，劉嵐，朱軍，等．兒童呼吸道感染苛氧菌耐藥性分析［J］．中華現代兒科學雜誌,2004,1(2)：106108.

　　［2］  王琴，孟曙芳，孔藝．134株嗜血杆菌體外抗生素敏感性分析［J］.檢驗醫學,2004,19(4)：304306.

　　［3］  葉應嫵，王毓三．全國臨床檢驗操作規程［M］.第2版.南京：東南大學出版社，1997：479486.

　　［4］  陳奇．中藥藥理研究方法學［M］.北京：人民衛生出版社，1993：261.

　　［5］  張玉妥，張豔芳，季建軍，等.中藥對耐甲氧西林葡萄球菌體外抑菌作用的研究［J］．江蘇中醫,2001,22(3)：43．

［6］  薑敏，楊永弘．流感嗜血杆菌對常用抗生素的耐藥性及耐藥機製［J］.國外醫學兒科學分冊,2004,31(5)：228230.