金銀花二氧化碳超臨界萃取物的體外抑菌作用研究

【摘要】  目的研究金銀花CO2超臨界萃取(SFE)物的體外抑菌作用。方法采用瓊脂擴散法和試管稀釋法研究金銀花的5種提取工藝，即SFE萃取、SFE-C萃取(C表示帶夾帶劑)、乙醇提取、超聲波提取、共水蒸餾（SD）法提取，所得提取原液藥物對6種細菌，即金黃色葡萄球菌、大腸杆菌、枯草芽孢杆菌、白色葡萄球菌、綠膿杆菌、鼠傷寒沙門氏菌的抑菌作用。結果5種提取原液藥物對6種細菌均有一定抑製作用，而且SFE萃取物對綠膿杆菌的MIC 為1∶16；SFE-C萃取物對金黃色葡萄球菌和綠膿杆菌的 MIC 均為1∶16。結論與傳統的提取方法相比，采用SFE-C和SFE工藝得到的萃取物含非綠原酸類熱敏抗菌物質，提高了金銀花的抗菌效果。

【關鍵詞】  金銀花 二氧化碳超臨界萃取 夾帶劑 體外抑菌

    Abstract：ObjectiveTo research the growth inhibition of CO2-SFE extracts from Lonicerae on bacteria in vitro. MethodsThe agar diffusion and tube dilution methods were used to study the growth on bacteria inhibition of the Lonicerae extracts with five different kinds of extraction approaches, which were SFE extraction, SFE-C extraction, alcohol extraction, ultrasonic extraction and SD extraction, by applying them to the following bacteria: Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylococcus albus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium. ResultsAll Lonicerae extracts with five kinds of extractions were effective to the bacteria;the MIC against Pseudomonas aeruginosa of SFE extracts was 1∶16；The MIC against Staphylococcus aurous and Pseudomonas aeruginosa of SFE-C extracts was 1∶16. ConclusionCompared with the conventional extractions methods, the extracts with SFE-C extraction and SFE extraction include the heat-sensitive substances which would enhance the inhibiting bacteria ability.

    Key words：Lonicerae;   CO2 Supercritical extraction;   Cosolvent;   In vitro inhibition

    金銀花為忍冬科Caprifoliaceae忍冬屬Lonicera植物的幹燥花蕾或帶初開的花，為中醫常用藥，具有清熱解毒、涼風散熱之功效［1］。現代藥理研究表明金銀花具有較為廣泛的藥理作用，如抗菌、抗病毒、抗炎解熱、保肝、抗生育、抗氧化、止血等，這些研究為金銀花的臨床用藥提供了科學依據，但所確定的有效部位均是水提取物或醇提取物［2，3］，有效成分不夠明確和具體，因此難以建立有效的質量控製方法。

    針對以上不足，我們采用不同的提取工藝，對金銀花加入夾帶劑CO2超臨界（SFE-C）萃取［4］、未加夾帶劑CO2超臨界(SFE)萃取［5］、乙醇醇提取［6］、超聲波提取、共水蒸餾法（SD）提取［7］5種提取原液藥物中的揮發油類、黃酮類及綠原酸類成分分別進行了富集處理，采用瓊脂擴散法和試管稀釋法對各個提取物進行了體外抑菌實驗研究。

    1  儀器與材料

    1.1  藥品JYH-1(采用SFE-C工藝提取物，其中JYH-X表示第x種金銀花提取物，後麵括號給出提取工藝說明)：山東產金銀花藥材，烘幹，研碎，再放入萃取釜，加入夾帶劑，在35 ℃下，萃取 2 h，將萃取物中溶劑夾帶劑旋轉蒸發除掉得到萃取物（萃取率為18.61 ％，綠原酸得率為 69.52 ％）。

    1.1.1  JYH-2(SFE萃取物)山東產金銀花藥材，烘幹，研碎，再放入萃取釜中，在萃取溫度為 35 ℃下，萃取時間 2 h，得萃取物揮發油（萃取率為1.08 ％）。

    1.1.2  JYH-3(醇提綠原酸)山東產金銀花藥材，烘幹，研碎，10倍量的75 ％ 乙醇回流2次，60℃，0.5 h/次，再回收乙醇，水浴濃縮，蒸餾水洗入100 ml容量瓶，定容得到綠原酸提取物（得率為79.43 ％）。

    1.1.3  JYH-4(超聲波提取黃酮)山東產金銀花藥材，烘幹，研碎，放入錐形瓶中，加入95 % 乙醇50 ml，在冰水浴中用超聲波振蕩器振蕩20 min，將提取液過濾至100 ml容量瓶中，殘渣再重複振蕩提取2次，將3次的濾液合並，在水浴上減壓蒸餾得到黃酮提取物（黃酮的含量為0.002 9%）。

    1.1.4  JYH-5(SD法提取揮發油)取金銀花適量，參照2005年版《中國藥典》Ⅰ部的方法用水蒸氣蒸餾法提取金銀花揮發油，提取時間6 h，得到金銀花揮發油（得率為 0.025%）。

    1.2  培養基

    1.2.1  固體培養基 牛肉膏蛋白腖細菌培養基：蛋白腖10.0 g，牛肉提取物3.0 g，氯化鈉5.0 g，瓊脂15.0 g，蒸餾水1 000 ml，pH 7.0。

    1.2.2  肉湯培養基蛋白腖10.0 g，牛肉提取物3.0 g，氯化鈉5.0 g，蒸餾水1 000 ml，pH 7.0。

    1.3  菌株所用菌株包括由浙江工業大學生物製藥研究所提供的金黃色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大腸杆菌以及由中國科學院微生物研究所購得的綠膿杆菌、白色葡萄球菌、鼠傷寒沙門氏菌共6種。

2  方法

    2.1  測藥物的抑菌圈直徑定性分析藥物的抗菌作用采用瓊脂擴散法［8］。每平皿加0.1 ml 菌液（菌液濃度為 1.0×105 cfu/ml），塗布整個培養基表麵，37 ℃，吸附 30 min。然後上麵均勻放置 4 個直徑約為 6 mm 的無菌不鏽鋼牛津杯。然後用移液器在孔中加藥液 200 μl；37 ℃恒溫培養箱內培養 24 h 後，觀察並記錄抑菌圈的有無及其直徑大小（重複 2 次，每次做 4 孔，求直徑的平均值）。

    2.2  定量測量藥物對細菌的最低抑菌濃度 (MIC) 及最小殺菌濃度 (MBC)采用試管稀釋法，（每種藥物每種菌）用無菌小試管11隻排於試管架，第1隻不加肉湯培養基，第2～11管各加1 ml；於第1隻試管中加入配置好的藥液2 ml，然後取 1 ml 加入第2管，混勻後取1 ml 加入第3管，依次倍比稀釋，自第10管吸出1 ml 棄去，第11管係對照管。將各管中加入已校正濃度的菌液（1.0×105 cfu/ml）0.1ml，混勻後放置37 ℃培養24 h ，觀察結果，找出阻止細菌生長的最低藥物濃度，3次實驗結果的平均值即為金銀花的最小抑菌濃度（MIC）。將MIC以上濃度的培養基各濃度取 0.1 ml傾注瓊脂培養基（每濃度做3皿），37 ℃，24 h後，觀察細菌生長情況，以每藥物最低無菌生長濃度（3皿都無菌生長）來判斷各藥物的最低殺菌濃度（MBC）。

    3  結果

    3.1  藥物的抗菌作用JYH-1，JYH-2，JYH-3，JYH-4和JYH-5這5 種提取原液藥物的生藥含量分別為5.4，92.6，1，2.6，4.0 kg /ml。按照實驗方法“2.1”，對6種細菌做抗菌實驗。實驗結果見表1。由表1可見，5種提取原液藥物對6 種細菌均有一定抑製作用。表1  各種金銀花提取物抑菌圈直徑的比較“-”表示無抑菌圈；n＝8

    3.2  藥物對細菌的最低抑菌濃度 (MIC) 及最小殺菌濃度 (MBC)按照“2.2”項下方法進行實驗。結果見表2～3。表2顯示，醇提綠原酸抑菌效果最顯著，對大腸杆菌、金黃色葡萄球菌、白色葡萄球菌、綠膿杆菌、枯草芽孢杆菌的MIC均為1∶16；SFE-C 萃取物對金黃色葡萄球菌和綠膿杆菌抑菌作用較強，其MIC均為1∶16；SFE萃取物對綠膿杆菌作用較強，其MIC為1∶16；SD揮發油抑菌作用最差，說明SFE萃取物揮發油強於SD揮發油抑菌效果，SFE萃取物揮發油也有一定的抑菌效果。表2  各種金銀花提取物最小抑菌濃度表3  各種藥物最小殺菌濃度 “-”表示無最小殺菌濃度

    表3顯示，醇提物（綠原酸含量79.4％）殺菌效果最顯著，對大腸杆菌、金黃色葡萄球菌、綠膿杆菌的MBC 均為1∶8，SFE-C 萃取物對綠膿杆菌抑菌作用較強，其MBC 為1∶8；而超聲提取黃酮和SD 揮發油殺菌作用弱，說明SFE-C 萃取物（其中綠原酸占26 ％，是醇提物的1/3）殺菌效果強於超聲提取黃酮和SD 揮發油，接近於醇提綠原酸殺菌效果，綜合考慮綠原酸含量，MBC，MIC，表明SFE-C 萃取物中含有醇提物中所沒有的非綠原酸類抑菌物質；文獻報道［9］金銀花中有熱敏性抑菌成分。SFE-CO2可較好地避免熱敏成分破壞 (本文采用35℃)。本部分結果提示，金銀花中含非綠原酸類熱敏抑菌物質，使金銀花的抑菌效果提高。

    4  結論

5種提取原液藥物對6 種細菌均有一定抑製作用， SFE-C萃取物對金黃色葡萄球菌和綠膿杆菌的 MIC 均為1∶16；SFE萃取物對綠膿杆菌的MIC 為1∶16。綜合考慮綠原酸含量，MBC，MIC，可知SFE萃取物和SFE-C 萃取物中含有醇提物中所沒有的非綠原酸類抑菌物質。金銀花中含非綠原酸類熱敏抑菌物質，使金銀花的抗菌效果提高。這方麵工作值得進一步研究。

作者：蘇香萍 龔大春 張亞雄 龔美珍《時珍國醫國藥》

【參考文獻】

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［8］ 潘清平，雷誌君，周日寶，等. 灰氈毛忍冬與正品金銀花抑菌作用的比較研究［J］. 中醫藥學刊,2004,22(2)：243.

［9］ 沈映君. 中藥藥理學［M］. 北京：人民衛生出版社,2000：230.

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