【摘要】 目的 了解銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)臨床分離株對幾種常用抗銅綠假單胞菌藥物的敏感性；探索銅綠假單胞菌臨床分離株對亞胺培南和美羅培南耐藥性差異與其膜孔蛋白OprD2變化的關係。方法 瓊脂對倍稀釋法測定142株Pa對亞胺培南、美羅培南等8種常用抗假單胞菌藥物的最低抑菌濃度，從中篩出32株對亞胺培南和美羅培南不同耐藥表型的Pa，提取外膜蛋白並采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法分離，檢測OprD2相對含量。結果 耐藥率最高的是亞胺培南(54.23%)，其次是環丙沙星(45.07%)、美羅培南(28.87%)、氨曲南(19.72%)、阿米卡星(17.61%)、呱拉西林/三唑巴坦(14.08%)和頭孢他啶(11.97%)，頭孢呱酮/舒巴坦耐藥率最低(9.86%)。呈現多重耐藥的菌株占38.73%(55/142)，交叉耐藥率高達40.84%(58/142)。在對亞胺培南耐藥的菌株中，合並有其他β-內酰胺類抗生素耐藥的菌株達到62.34%(48/77)。32株Pa外膜蛋白電泳結果顯示OprD2相對含量在耐藥組為0～3.5%(其中有一株為8.70%)，敏感組為6.20%～10.20%。在碳青黴烯類耐藥組與敏感組之間統計分析P<0.05，耐碳青黴烯類組低於敏感組，但是在亞胺培南耐藥、美羅培南敏感組與亞胺培南、美羅培南均耐藥組之間差異無統計學意義。結論銅綠假單胞菌耐藥菌株常見，且常呈多重耐藥和交叉耐藥。亞胺培南耐藥率高於美羅培南。膜孔蛋白OprD2減少或缺失是我院Pa對亞胺培南耐藥的主要原因之一。但在美羅培南耐藥中所起的作用，有待進一步研究。
【關鍵詞】 銅綠假單胞菌； MIC； 耐藥性；亞胺培南； 美羅培南； OprD2
ABSTRACT Objective To study the activities of some commonly used antibiotics against Pseudomonas aeruginosa, investigate the correlation between the resistance phenotypes and the amounts of outer membrane protein (OpD2) of P.aeruginosa, and discuss the mechanism of different resistant phenotypes in P.aeruginosa. Methods The minimal inhibitory concentrations (MICs) of 8 antimicrobial agents against 142 clinical isolates were determined by agar dilution method. Membrane proteins of 32 strains with different resistant phenotypes to imipenem and meropenem were obtained by SDS-PAGE electrophoresis method and the relative amounts of OprD2 were determined. Results The resistant rate of imipenem was the highest (54.23%), followed by ciprofloxacin (45.07%), meropenem (28.87%), aztreonam (19.72%), amikacin (17.61%), piperacillin/tazobactam (14.08%), ceftazidime (11.97%) and cefoperazone/sulbactam (9.86%). The cross resistance rate to β-lactams was 40.84% (58/142), multi-drug resistance rate was 38.73% (55/142). It accounted for 62.34% (48/77), resistant to the other β-lactams in all isolates resistant to imipenem. Membrane proteins of 32 strains were isolated and determined by SDS-PAGE electrophoresis method. Result showed that the relative amounts of OprD2 ranged from 0 to 3.5% in strains resistant to carbapenems (except
a strain which OprD2 was 8.70%); others were from 6.20% to 10.20% in susceptible strains. The statistic results showed the relative amounts of OprD2 of 27 strains resistant to carbapenems were much than susceptible strains. Conclusions P.aeruginosa was frequently resistant to clinical antimicrobial agents, the most were cross resistant and multi-drug resistant strains. Resistance rate of imipenem was higher than that of meropenem. The loss or diminishment of OprD2 was the main reason for the imipenem resistance of P.aeruginosa in our hospital, but its effect on meropenem resistance deserved further study.
KEY WORDS Pseudomonas aeruginosa; MIC; Resistance; Imipenem; Meropenem; OprD2
銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)是臨床上常見的引起嚴重醫院感染的條件致病菌之一，大量研究顯示Pa對碳青黴烯類抗生素的耐藥率日漸上升。許多學者認為僅有OprD2蛋白減少或缺失，Pa可對亞胺培南耐藥而對美羅培南無影響，但此結果多數為試驗誘導菌株的研究，用於臨床株研究的尚少。本研究調查了142株非重複臨床Pa菌株對8種常用抗生素的敏感性、科室分布及標本來源情況；從中篩出32株對亞胺培南和美羅培南不同耐藥表型的Pa，采用十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法分離外膜蛋白，並檢測OprD2相對含量，探索臨床Pa分離株對亞胺培南和美羅培南耐藥性差異與其膜孔蛋白OprD2之間的關係。
1 材料和方法
1.1 抗生素敏感性試驗
(1)試驗菌株 2005年1月～2005年7月四川大學華西醫院臨床標本中分離到的142株非重複銅綠假單胞菌行體外藥物敏感試驗，經Microscan Walkaway-40型全自動細菌鑒定儀鑒定。
質控菌株銅綠假單胞菌ATCC27853由四川大學華西醫院感染病中心抗感染藥物研究室提供；PAO1為銅綠假單胞菌的野生標準株由四川大學華西醫學院基礎學院微生物室提供。
(2)藥品、試劑和儀器 頭孢他啶(AZ)、阿米卡星(AMK)、頭孢呱酮(CPZ)、呱拉西林(PIPC)、環丙沙星(CPLX)、舒巴坦(SB)和三唑巴坦(TB)均為標準品，購自中國藥品生物製品檢定所；氨曲南(AZ)為中美上海施貴寶製藥有限公司產品；亞胺培南(IMP)為杭州默沙東製藥有限公司產品；美羅培南(MRP)為深圳市海濱製藥有限公司產品；CCCP和PAβN購自Sigma公司。
培養基為水解酪蛋白(MH)瓊脂，購自杭州天和微生物試劑有限公司。
A-400型多點接種儀，英國Denley Instruments有限公司；細菌比濁儀，法國Bio-Merieux公司。
(3)試驗方法 瓊脂平皿對倍稀釋法測定最低抑菌濃度(MIC)。按照美國國家臨床試驗室標準研究所(CLSI/NCCLS)推薦方法測定亞胺培南、美羅培南、氨曲南、頭孢他啶、頭孢呱酮/舒巴坦、呱拉西林/三唑巴坦、環丙沙星和阿米卡星對142株Pa的MIC值。
(4)統計方法 統計軟件為SPSS 13.0，χ2檢驗法分析亞胺培南和美羅培南耐藥率之間統計學意義。
1.2 外膜蛋白OprD2的檢測
(1)試驗菌株 從藥敏結果篩選出30株不同耐藥表型的Pa，分成三組：第一組為對亞胺培南及美羅培南均敏感的菌株，共3株；第二組為對亞胺培南耐藥、對美羅培南敏感的菌株，共10株；第三組為對亞胺培南及美羅培南均耐藥的菌株，共17株。另有2株(銅綠假單胞菌ATCC27853和PAO1)對亞胺培南及美羅培南均敏感的菌株，歸為第一組。
(2)試劑和儀器 十二烷基肌氨酸鈉和十二烷基磺酸鈉(SDS)購自Sigma公司；LB肉湯為宜興市永信生物有限公司產品；Tris由上海Sangong有限公司生產；丙烯酰胺為Merck公司產品；亞甲基雙丙烯酰胺為Gincobrl公司產品；甘氨酸和四甲基乙二胺(TEMED)為德國Fluka公司產品；蛋白質分子量Marker購自Fermentas公司。超聲細胞破碎儀由美國Sonics＆materials公司生產；高速冷凍離心機產自德國Heraeus公司；凝膠成像係統為美國BIO-RAD公司產品；紫外分光光度計產自Beckman公司；垂直電泳儀美國BIO-RAD公司產品。
(3)試驗方法
外膜蛋白的製備 參考國外文獻報道方法［1］製備外膜蛋白，具體步驟如下：①25%甘油肉湯保存的菌株在MH瓊脂平皿上複蘇16h；②挑取單個菌落接種於20ml LB肉湯中，於
外膜蛋白的分離 采用SDS-PAGE法，按參考文獻［2］進行，12%分離膠，5%濃縮膠，取純化的外膜蛋白樣品10μl溶於等體積樣品緩衝液中，
(4)統計方法 統計軟件SPSS 13.0，方差分析法比較三組間OprD2相對含量有無差異。
2 結果
2.1 抗生素敏感試驗
(1)142株銅綠假單胞菌對8種抗生素的體外藥物敏感試驗 結果見Tab.1。耐藥率由高到低為：亞胺培南(54.23%)、環丙沙星(45.07%)、美羅培南(28.87%)、氨曲南(19.72%)、阿米卡星(17.61%)、呱拉西林/三唑巴坦(14.08%)、頭孢他啶(11.97%)和頭孢呱酮/舒巴坦(9.86%)。標本來源見Tab.2，標本科室分布見Tab.3。
(2)亞胺培南、美羅培南耐藥性差異 對亞胺培南及美羅培南均耐藥的株菌有40株；僅對亞胺培南耐藥對美羅培南敏感菌株有11株；僅對美羅培南耐藥對亞胺培南敏感菌株0株。亞胺培南耐藥率(54.23%)，高於美羅培南(28.87%)，有顯著性差異。
(3)多重耐藥菌株和交叉耐藥率高 大多數耐藥菌株為多重耐藥、交叉耐藥，單一耐藥的極少。本實驗資料顯示，呈現多重耐藥的菌株占38.73%(55/142)，其中21.83%(31/142)對β-內酰胺類和環丙沙星均耐藥，13.38%對β-內酰胺類、阿米卡星和環丙沙星均耐藥，2.11%對環丙沙星和阿米卡星耐藥，1.41%對β-內酰胺類和阿米卡星耐藥。交叉耐藥率高達40.84%(58/142)，其中19.72%(28/142)對兩種β-內酰胺類抗生素交叉耐藥，11.97%對三種β-內酰胺類抗生素交叉耐藥，還有1株對本實驗選用的所有抗菌藥物均耐藥。在對亞胺培南耐藥的菌株中，合並有其他β-內酰胺類抗生素耐藥的菌株達到62.34%(48/77)(Tab.4)。
2.2 外膜蛋白OprD2的檢測電泳結果和凝膠成像係統測定OprD2相對含量結果見Fig.1和Tab.5。統計結果顯示，第一組與第二組間(P<0.05)、第一組與第三組間(P<0.05)均有顯著性差異，可以認為該兩組間OprD2量有差異，所以OprD2蛋白的減少或缺失是銅綠假單胞菌對碳青黴烯類抗生素耐藥的主要原因之一。第二組和第三組之間P>0.749(>0.05)，無顯著性差異。
3 討論
Pa是一類無芽孢非發酵革蘭陰性杆菌。廣泛存在於自然界，當機體免疫力低下時可引起多種感染。據我院臨床微生物實驗室資料，2003年Pa的分離率在革蘭陰性杆菌中僅低於大腸埃希菌居第二位，2004年銅綠假單胞菌升為第一位(華西醫院內部資料)。這一結果與國內、外文獻報道一致［3～5］。
本實驗收集的資料分析可見，Pa感染最多見的科室依次是ICU、呼吸科、胸外科、幹部病房、神經外科、神經內科、腫瘤科、感染科、血液科、燒傷科和普外科，分別占31.69%、11.97%、7.04%、6.34%、4.93%、 4.23%、4.23%、3.52%、3.52%、3.52%和3.52%。標本來源中痰標本占絕大部分(88.73%)。從科室分布及標本來源我們可以看出Pa感染的特點：①ICU是醫院內感染發生的主要場所，也是Pa感染的重要場所；②Pa感染可以侵犯人體多個器官係統，包括呼吸道、皮膚、膽道、腦脊液和血液等，主要以呼吸道為主，是最常見的醫院獲得性肺炎的病原體。所以在分析感染病原體的時候我們應該考慮到上述易感因素的存在，合理選擇抗生素。
從藥敏結果看Pa耐藥率相當高，交叉耐藥、多重耐藥菌株多。1991年Watanabe等認為OprD2蛋白是目前所知的Pa外膜中惟一對抗生素通透有意義的孔道蛋白，具有配體特異性，是亞胺培南的特異結合位點，而頭孢菌素、青黴素類等均不能通過OprD2通道，所以碳青黴烯類與其他的β-內酰胺類抗生素無交叉耐藥性［6］。但近年國內、外大量報告顯示大部分耐藥Pa存在交叉耐藥(包括氨曲南)，與本實驗結果一致，這可能是多種耐藥機製(金屬酶，高產AmpC酶及外排泵等)同時存在的緣故［7］。IMP耐藥率(54.23%)高於美羅培南(28.87%，P<0.05)，比國內外報道的耐藥率均高［8，9］，與我院內部2004年統計細菌耐藥資料基本一致(華西醫院內部資料)。從結果來看，敏感率由高到低是：呱拉西林/三唑巴坦、阿米卡星、頭孢呱酮/舒巴坦、頭孢他啶、氨曲南、美羅培南、環丙沙星和亞胺培南。由此可以看出亞胺培南在我院已經不宜作為治療Pa的經驗性選擇藥物，這可能與我院亞胺培南使用廣泛或耐藥菌的交叉感染有關。
Quinn等［10］在1986年第一次對膜孔蛋白OprD在Pa對碳青黴烯類藥物耐藥機製中所起的作用做了報道，OprD分為D1、D2和D3。目前研究發現與亞胺培南耐藥有關的為OprD2，Pa外膜蛋白OprD2孔道是小分子的亞胺培南選擇性快速進入菌體的特異性通道［11］。Suzuki等［12］研究發現，對於僅因OprD2缺失引起的亞胺培南耐藥的菌株對美羅培南仍敏感。Trias等［13］也發現這一現象，認為是亞胺培南比美羅培南帶有更大的正電荷，所以對於OprD2更具有依賴性。Kohler等［14］認為亞胺培南與美羅培南均以OprD2蛋白減少或缺失作為首要的耐藥機製，但美羅培南還需要MexAB-OprM的過度表達作為第二耐藥機製。本實驗檢測結果顯示檢測的27株耐碳青黴烯類的Pa中11株有OprD2量明顯減少，15株未檢測到OprD2(明顯減少或缺失)，僅1株(66號)為8.70%，OprD2量沒有顯示減少，可能與其他機製所致耐藥有關。統計顯示，碳青黴烯類耐藥組和敏感組間OprD2量有明顯差異，而第二組和三組之間沒有OprD2量的差異，並沒有因為第三組還存在對美羅培南耐藥導致OprD2的量更少。在第二組中幾乎都有OprD2的減少，但是對美羅培南卻敏感，說明OprD2對美羅培南的影響較小。由於本實驗缺少對美羅培南耐藥、亞胺培南敏感的菌株，所以難以了解這類Pa中OprD2的情況。Giske等［15］的實驗顯示一株美羅培南中介亞胺培南敏感的Pa仍然有OprD2量的減少(從mRNA水平分析)。由於這種隻對美羅培南耐藥而亞胺培南敏感的Pa菌株很少，所以相關研究也極少。故OprD2減少或缺失是Pa對亞胺培南耐藥的主要原因之一，但是在美羅培南耐藥中所起的作用因缺乏大量臨床菌株的實驗數據，有待進一步研究，所以監測該類耐藥株並研究其OprD2蛋白情況值得關注。
作者：劉永芳 呂曉菊 俞汝佳 宗誌勇 高燕渝 陳慧莉 李曉芳 蔣勝 韓乾國《中國抗生素雜誌》
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