β-內酰胺類抗生素對產ESBL肺炎克雷伯菌小鼠肺炎療效研究

【摘要】  目的 評價幾種β內酰胺類抗生素對不同的產超廣譜β內酰胺酶(ESBL)肺炎克雷伯菌動物肺炎模型的療效。方法選擇臨床分離的2株對實驗用抗生素敏感的產ESBL肺炎克雷伯菌建立小鼠肺炎模型。根據細菌分為GX6998和Tian 29兩組，於感染後6h給藥。對照組腹腔注射生理鹽水0.5ml；治療組分別給予頭孢呱酮/舒巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟和呱拉西林/三唑巴坦。連續治療72h後，根據細菌計數結果評價療效。結果 體外藥敏試驗表明Tian 29對4種抗生素的MIC值均大於GX6998，但仍在敏感範圍內。4種抗生素治療後，各組病死率均顯著減低。GX6998組中4種抗生素均可顯著降低肺組織勻漿的細菌計數(P<0.01)。Tian 29組中頭孢呱酮/舒巴坦、頭孢他啶可以顯著降低肺組織勻漿的細菌計數(P<0.05)；頭孢吡肟和呱拉西林/三唑巴坦也可使組織勻漿的細菌計數減少，但與對照組比較差異無顯著性(P>0.05)。比較同一種抗生素對2株細菌的清除作用發現，4種抗生素對GX6998的清除作用均強於Tian 29(P<0.01)。結論 體外敏感的廣譜β內酰胺類抗生素和β內酰胺酶抑製劑複合製劑治療產ESBL肺炎克雷伯菌感染均可顯著降低動物模型的死亡率，減少肺組織勻漿細菌計數。但如果細菌對抗生素的MIC升高，將會影響治療效果。

【關鍵詞】  超廣譜β內酰胺酶； β內酰胺類抗生素； 肺炎克雷伯菌； 藥效學

    ABSTRACT  Objective  To evaluate the efficacy of several βlactams against ESBL producing Klebsiella pneumoniae pneumonia in a mouse model of peneumonia.  Methods  Two clinical Klebsiella pneumoniae strains susceptible to the experimental antimicrobial agents, Klebsiella pneumoniae GX6998 and Tian 29, were divided into two groups for mouse pneumonia infection respectively. After sixhour infection, mice were intraperitoneally injected with 0.5ml 0.9% NaCl for control; mice were intraperitoneally injected with ceftazidime, cefepime, cefoprazone plus sulbactam and piperacillin plus tazobactam respectively for trial. Seventytwo hours later, therapy efficacies were evaluated with bacterial counts.  Results  All the trial groups had significantly lower mortality than control groups (P<0.05). Compared with the control groups, in GX6998infected groups, the bacterial amounts with all the testing agents were significantly decreased (P<0.01); in Tian 29infected group, the bacterial amounts with cefoprazone plus sulbactam and ceftazidime were significantly decreased (P<0.05); in cefepime and piperacillin plus tazobactam groups, bacterial amounts were reduced without significant difference with that of the control group (P>0.05).  Conclusion  The combinations of broadspectrum βlactams and βlactamases inhibitor could reduce the mortality and bacterial amountsin mouse pneumonia model which were susceptible to ESBLsproducing Klebsiella pneumonia strains. However, the clinical efficacy would be reduced when the MIC increased.

    KEY WORDS  Extended spectrum βlactamases;  βLactams  Klebsiella pneumonia;  Pharmacodynamics

    肺炎克雷伯菌是院內下呼吸道感染的主要致病菌。我國院內感染的肺炎克雷伯菌43%為產超廣譜β內酰胺酶(ESBL)菌株［1］。感染產ESBLs肺炎克雷伯菌患者的預後明顯較感染不產ESBLs肺炎克雷伯菌患者差［2］，能否使用廣譜β內酰胺類抗生素治療此類感染一直存在爭議。本研究通過小鼠肺炎模型評價幾種臨床常用的廣譜β內酰胺類抗生素和酶抑製劑複合製劑對產ESBLs肺炎克雷伯菌動物肺炎的療效。

    1  材料與方法

    1.1  材料

    (1)觀察藥品  頭孢他啶(Glaxo Smithkline公司，批號C076348，純度89.4%)；頭孢吡肟(BristalMyers Squibb公司，批號0505793，純度88.6%)；頭孢呱酮/舒巴坦(Pfizer公司，批號45839147，純度96.6%)；呱拉西林/三唑巴坦(Wyeth公司，批號A56167，純度88.6%)。

    1.2  實驗菌株

    使用臨床分離的產ESBLs肺炎克雷伯菌GX6998和Tian 29建立肺炎模型，菌株來自國家食品藥品監督管理局細菌耐藥性監測中心。ESBLs表型確證試驗按CLSI/NCCLS(2002年)標準紙片擴散法操作。

    1.3  實驗動物

    雄性昆明種小白鼠，體重(25±2)g，購自中國醫學科學院動物研究所。

    1.4  產ESBL肺炎克雷伯菌最小抑菌濃度(MIC)測定

    細菌MIC的測定采用CLSI/NCCLS(2002年)推薦的微量肉湯稀釋法，使用大腸埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603作為質控菌［3］。

    1.5  建立肺炎模型

    將菌株密集劃線於MH培養基上，37℃恒溫箱培養18h後用生理鹽水衝洗菌苔，菌懸液用生理鹽水稀釋到5×1010CFU/ml，取30μl(1.5×108CFU)用於製備肺炎模型。

    實驗小鼠稱重後腹腔注射10%水合氯醛(0.4ml/g)麻醉，自頸部正中切開皮膚，鈍性分離直至暴露氣管。用1ml注射器將30μl菌懸液經氣管緩慢注入後將小鼠直立搖晃3min，使細菌盡量均勻分布於兩肺。

    1.6  動物分組及給藥方案

    將小鼠隨機分為兩組，分別接種肺炎克雷伯菌GX6998和Tian 29。兩組內再根據治療措施不同分為對照組和頭孢呱酮/舒巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟和呱拉西林/三唑巴坦4個抗生素組。治療開始於接種細菌後6h，對照組每8h腹腔注射生理鹽水0.5ml；4個抗生素組分別每8h腹腔注射頭孢呱酮/舒巴坦200mg/kg、頭孢他啶200mg/kg、頭孢吡肟200mg/kg，每6h腹腔注射呱拉西林/三唑巴坦120mg/kg，以上方案連續應用3d後統計各組的病死率。之前的藥動學實驗表明，此給藥方案可以保證4種抗生素的血清藥物濃度大於肺炎克雷伯菌GX6998 MIC值的時間超過給藥間隔的40%。

    1.7  細菌計數測定

    各組分別於治療前及治療後24、48和72h(最後一次給藥後4h)各時間點將小鼠處死後充分放血，取雙肺，冰生理鹽水衝洗3次，置於玻璃勻漿器中加入2ml生理鹽水研磨15min，製成肺組織勻漿。10倍倍比稀釋肺組織勻漿，依次取各濃度100μl接種於MH瓊脂培養基上，35℃恒溫孵育18h，選取菌落在30～300個之間的平板進行菌落計數。

    1.8  統計學分析

    采用SPSS11.5統計軟件包進行統計分析，計量資料以均數±標準差表示，兩組間均數比較采用t檢驗，多組間均數比較采用方差分析，組間兩兩比較應用q檢驗，計數資料采用卡方檢驗，P<0.05認為有顯著性差異。

2  結果

    2.1  MIC測定結果

    Tian 29對4種抗生素的MIC值均大於GX6998，但仍在敏感範圍內(表1)。

    2.2  病死率比較

    兩組中，頭孢呱酮/舒巴坦、頭孢他啶、頭孢吡肟以 表1      2株細菌對4種抗生素的MIC值(mg/L)以頭孢呱酮的標準判讀此結果。

    及呱拉西林/三唑巴坦治療後與對照組比較病死率顯著降低。各抗生素組間病死率比較無顯著差異(表2)。

    2.3  細菌計數結果

    (1)4種抗生素對GX6998感染的療效比較  治療72h後，4種抗生素都可以顯著降低肺組織的細菌量(P<0.01)；治療前後細菌計數的差值與對照組比較均有顯著性差異(P<0.01)；各抗生素組間比較無顯著性差異(表3)。表2  4種抗生素治療2株細菌感染的病死率比較表3      4種抗生素對GX6998殺菌作用比較 *：與治療前比較P<0.01；  **：與對照組比較P<0.01。

    (2)4種抗生素對Tian 29感染的療效比較  治療72h後，頭孢呱酮/舒巴坦和頭孢他啶可顯著降低肺組織的細菌量，治療前、後細菌計數的差值與對照組比較有顯著性差異(P<0.05)；頭孢吡肟和呱拉西林/三唑巴坦治療72h後細菌計數有所減少，但和治療前比較無顯著性差異，治療前、後細菌計數的差值與對照組比較也無顯著性差異(表4)。

    (3)同一抗生素對2株細菌感染的療效比較  比較兩組中每一種抗生素治療前後肺組織細菌計數的差值發現，4種抗生素對GX6998的清除作用均強於Tian 29(表5)。 表4      比較4種抗生素對Tian 29殺菌作用表5  比較4種抗生素對2株菌的殺菌作用

    3  討論

    本研究通過觀察4種臨床常用的廣譜β內酰胺類抗生素治療產ESBLs肺炎克雷伯菌導致的小鼠肺炎，發現4種抗生素均對MIC值較低的細菌GX6998清除作用較好；對細菌Tian 29清除作用較差，即使Tian 29對這些抗生素也敏感，提示即使廣譜β內酰胺類抗生素對產ESBLs肺炎克雷伯菌敏感，隨著MIC值的升高其治療效果也會逐漸減弱。

    廣譜β內酰胺類抗生素因為對產β內酰胺酶和廣譜β內酰胺酶的革蘭陰性菌治療效果良好，一直被廣泛應用於臨床。研究發現，廣譜β內酰胺類抗生素治療敏感的產ESBLs細菌感染往往不能達到預期的效果，其治愈率和生存率明顯低於碳青黴烯類、頭黴素類、氟喹諾酮類和氨基糖苷類抗菌藥物，所以不建議用於治療產ESBLs細菌導致的感染［4］。

    目前認為β內酰胺抗生素治療產ESBLs細菌感染失敗的主要原因之一是接種量效應。腸杆菌科細菌對所有的β內酰胺類抗生素均有不同程度的接種量效應，其中頭孢吡肟最明顯［5］。但是接種量效應並不能說明使用β內酰胺類抗生素治療一定無效。Maglio等［6］在實驗中選擇了多株產ESBLs大腸埃希菌建立動物感染模型，雖然體外實驗也表現明顯的接種量效應，但體內實驗發現感染部位105和107CFU/ml細菌量對於頭孢吡肟的治療效果並沒有影響。ThanvinEliopoulos等用呱拉西林/三唑巴坦和頭孢吡肟治療產ESBL的肺炎克雷伯菌大鼠腹腔膿腫模型，也得到相同的結果［7］。兩項研究均表明，血清藥物濃度大於藥物對細菌的MIC的時間(% T>MIC)是判斷β內酰胺類抗生素抗感染療效的有效指標。

    本實驗選擇了2株對4種抗生素都敏感的產ESBL肺炎克雷伯菌建立肺炎模型，結果顯示，在GX6998組中4種抗生素都可以明顯減少肺組織的細菌計數；在Tian 29組中，頭孢呱酮/舒巴坦和頭孢他啶也可以顯著減少肺組織的細菌計數；頭孢吡肟和呱拉西林/三唑巴坦雖然可以使細菌計數有一定的減少，但和對照組比較沒有顯著性差異；4種抗生素在GX6998組中的細菌清除的效果均好於Tian 29組。這是由於β內酰胺類抗生素屬時間依賴性抗生素，要達到理想的治療效果，要求采取的給藥方式能夠使% T>MIC不少於40%～50%給藥間隔時間［8］。本次實驗同時進行的藥物濃度檢測結果，由於4種抗生素對Tian 29的MIC升高，使此組中4種抗生素的% T>MIC小於40%，甚至不到30%。

    我們的實驗表明使用體外敏感的廣譜β內酰胺類抗生素和β內酰胺酶抑製劑複合製劑治療產ESBL肺炎克雷伯菌感染，可以明顯降低動物模型的死亡率，可以顯著減少肺組織勻漿活菌計數。但如果細菌對抗生素的MIC升高，即使仍在敏感範圍內，仍將影響治療效果，甚至導致治療失敗。

分析以往的臨床研究發現，隨著MIC值降低，敏感的廣譜β內酰胺類抗生素治療產ESBL細菌感染的失敗率逐漸減低［4，9］。目前，隨著碳青黴烯類、頭黴素類抗生素應用增多，產ESBL細菌對它們的耐藥情況逐漸加重。產ESBL細菌常攜帶多種耐藥基因，同時對氟喹諾酮類和/或氨基糖苷類抗菌藥物耐藥［10］，這樣大大限製了臨床用藥的選擇，給治療帶來困難。所以我們認為不應該完全限製廣譜β內酰胺類抗生素應用於此類感染，而是根據廣譜β內酰胺類抗生素的藥動學特點和對產ESBL腸杆菌科細菌的MIC選擇用藥。這就需要更多的大規模的臨床研究來評價此類抗生素治療產ESBL細菌感染的臨床療效。

作者：裴迎華 張傑 馬越 李景雲 《中國抗生素雜誌》

【參考文獻】

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