ICU常見病原菌及鮑曼不動杆菌質粒上耐藥基因的研究

【摘要】  目的 分析南昌大學一附院ICU常見菌的種類、分布、耐藥性及鮑曼不動杆菌(AB)質粒上的耐藥基因。方法 用Microscanautoscanφ型自動微生物分析儀鑒定到種並測定其對常用抗菌藥物的最低抑菌濃度(MIC50)，按美國臨床實驗室標準委員會(NCCLS)2003年版標準判斷結果，利用WHONET 5.2軟件進行統計和分析，並用聚合酶鏈式反應(PCR)分析AB質粒上的耐藥基因。結果 ICU分離菌中革蘭陰性菌占75.3%，常見的菌種有銅綠假單胞菌(16.27%)、金葡菌(15.66%)、AB(15.06%)和肺炎克雷伯菌(14.66%)，非發酵菌的分離率明顯上升，占分離菌總數的42.77%，87.35%的標本來自痰液。革蘭陰性菌耐藥率高，AB對包括IPM在內的13種常用抗生素均高度耐藥且其質粒上攜帶可接合傳遞並穩定傳代的三種耐藥基因。結論細菌的多重耐藥日趨嚴重，開展細菌耐藥性監測，對指導臨床合理使用抗生素，降低醫院感染率和病死率有重要意義。質粒上帶一種或多種可接合傳遞並穩定傳代的blaTEM1(EU022370)、blaPER1(EU022369)和blaOXA23(EU022368)基因是ICU AB多重耐藥的分子學機製之一。

【關鍵詞】  ICU； 鮑曼不動杆菌； 耐藥； 基因； 質粒

    ABSTRACT  Obejective  To investigate the species, distribution and drug resistance of isolates obtained from ICU of the first affiliated hospital of Nanchang University, and study the drug resistant gene of Acinetobacter baumannii (AB).  Methods  The minimal inhibitory concentrations (MICs) and bacteria were identified by Microscanautoscanφ automatic microbe analytic instrument and the results were anzlyzed according to NCCLS (2003) by WHONET 5.2 software. Drugresistant gene on plasmid of AB was performed by PCR. Results  Gramnegative strains accounted for 75.3% in ICU infections.The main pathogen included P.aerugiinosa (16.27%), Staph.aureus (15.66%), AB (15.06%) and K.pneumoniae (14.46%). The isolate rate of nonfermenting pathogen was increasing, accounted for 42.77% of total isolates, 87.35% isolates were obtained from the sputum. Drug resistant rates of Gramnegative bacteria were very high. AB isolates were resistant to all the 13 commonly used antibiotics including imipenem (IPM) and its plasmid harbored three kinds of genotypes could be transferred and hereditary stable.  Conclusion  The serious of bacterial multidrug resistanceis increasing, it is urgent to carry out surveillance of bacterial resistance for use antibiotics rationally in order to decrease the morbidity and fatality rates. Plasmid harboring one or more blaTEM1, blaPER1 and blaOXA23 genes which can be transferred and hereditary stable is one of the molecular mechanism of MDR AB in ICU infections.

    KEY WORDS  ICU;  Acinetobacter baumannii;  Drugresistant;  Gene;  Plasmid

    隨著抗生素的泛用和濫用，越來越多的細菌產生耐藥［1］，耐藥性不斷增強且播散迅速，甚至出現多重耐藥，這已成為一個全球性問題［2］。耐藥菌感染導致患者住院時間延長，費用增加，醫院感染發病率和病死率增高［3］，尤其對兒童、老人、慢性病患者和免疫功能低下者，特別是對ICU患者［4］的生命危害更大。對ICU感染常見菌的種類、分布、耐藥性進行分析，研究MDR AB質粒上的耐藥基因型，有助於指導ICU的臨床治療，促進ICU感染的恢複。在ICU，AB不斷增加［5］，許多AB菌株對β內酰胺類、氨基糖苷類和氟喹諾酮類抗生素高度耐藥［6］。MDR AB是近些年造成ICU感染治療困難的一個重要致病菌，因此，我們分析了ICU常見菌的種類、分布及耐藥特點，並對AB質粒上的耐藥基因進行了分型，探討了其質粒在院內感染耐藥傳遞中的重要作用。現將結果報告如下。

    1  材料與方法

    1.1  菌株來源

    2004年5月～11月南昌大學一附院檢驗科保存的ICU菌株共166株。

    1.2  藥敏試驗

    用Microscanautoscanφ型自動微生物分析儀通過微量稀釋法直接報告臨床分離菌對常用抗菌藥物的MIC50，按美國臨床實驗室標準委員會(NCCLS)2003年版標準判斷結果，大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853(江西省臨檢中心)作藥敏實驗質控菌；大腸埃希菌ATCC25922和肺炎克雷伯菌ATCC700603作PCR實驗對照(北京協和醫院王輝教授惠贈)。

    1.3  擴增引物

    TEM1、PER1、SHV1、VEB1、OXA10、OXA23、OXA24和SHV型基因擴增引物按文獻［7］，由TaKaRa公司合成。

    1.4  試劑

    質粒DNA小量純化試劑盒，Ex TaqTM Hot Start Version購自TaKaRa公司，氨苄西林購自上海Sangon，LB培養基為英國OXOID公司產品。

    1.5  PCR擴增AB耐藥基因

    PCR反應總體積50μl，其中引物各1μl，10×PCR(Mg2+)緩衝液5μl，dNTP 4μl，Taq酶0.25U，DNA模板2μl。擴增產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳。

    1.6  接合試驗

    選擇一株同時帶blaTEM1、blaPER1和blaOXA23基因且對實驗所用抗生素全耐藥的MDR AB作供體菌，大腸埃希菌ATCC25922作受體菌，進行接合試驗，挑單個接合子菌落在ABPC和ABPC的平板上各連傳三代，鑒定菌種，分析其產酶、藥敏、基因型及傳代的穩定性。

    1.7  數據分析

    藥敏結果用WHO全球細菌耐藥性監測網提供的WHONET5.2軟件進行統計分析。

2  結果

    2.1  細菌分布

    (1)菌種分布  在ICU分離的166株細菌中，革蘭陽性菌41株，占24.7%，革蘭陰性菌125株，占75.3%。在革蘭陽性菌中最常見的是金葡菌26株(15.66%)，其次為屎腸球菌6株(3.61%)等。在革蘭陰性菌中最常見的是銅綠假單胞菌27株(16.27%)，其次為AB 25株(15.06%)、肺炎克雷伯菌24株(14.46%)及嗜麥芽寡養單胞菌9株(5.42%)等。其中，非發酵菌的分離率近年來呈上升趨勢，占ICU分離細菌總數的42.77%。

    (2)標本分布  ICU分離的166株致病菌中痰液中分離的最多，有145株(87.35%)；其次為血液15株(9.04%)。

    2.2  ICU常見菌的耐藥狀況

    金葡菌僅對萬古黴素敏感性高；革蘭陰性菌耐藥率高，肺炎克雷伯菌僅對亞胺培南敏感，但AB對包括亞胺培南在內的13種常用抗生素均耐藥，嗜麥芽寡養單胞菌僅對環丙沙星敏感。各常見菌對臨床常用抗生素的耐藥率見表1。

    2.3  AB質粒上的耐藥基因型

    25株AB中有22株耐藥，其中15株質粒上帶有耐藥基因，共分離到3種耐藥基因型，1株僅帶blaTEM1基因，1株僅帶blaOXA23基因，7株同時帶blaTEM1和blaOXA23基因，6株同時帶blaTEM1(840bp)、blaPER1(925bp)和blaOXA23(1003bp)基因， 基因序列已登錄   表1        ICU常見菌的耐藥率 NCBI genebank(EU022368EU022370)，基因分型圖見作者的其它文章［7］。

    2.4  MDR AB接合試驗結果

    (1)供體菌、受體菌和接合子的藥敏  實驗結果表明，供體菌質粒上所帶的對複方磺胺甲口惡唑、氨苄西林、頭孢噻吩、頭孢泊肟、頭孢呋肟、亞胺培南和氨苄西林/舒巴坦的耐藥性傳給了受體菌，使得接合子對這些抗菌藥物耐藥或中度敏感(表2)。

    (2)供體菌和接合子的耐藥基因型  用blaTEM1、blaPER1和blaOXA23三對引物分別擴增供體菌和接合子質粒上的耐藥基因，結果表明接合子帶有與供體菌相同的blaTEM1、blaPER1和blaOXA23三種基因(圖1)。

    (3)接合子的傳代穩定性  接合子質粒上所攜帶的blaTEM1、blaPER1和blaOXA23三種耐藥基因在AMPC和AMPC麥康凱培養基中均能穩定傳代。

    3  討論

    ICU患者長期住院、大量使用廣譜抗菌藥物、經    表2  供體菌、受體菌和接合子的藥敏(MIC)實驗結果

    鮑曼不動杆菌大腸埃希菌25922接合子呱拉西林>64<8**<8**頭孢曲鬆>32<4**<4**頭孢他啶>16<8**<8**頭孢吡肟>16<2**<2**頭孢唑肟>32<4**<4**氨曲南>16<8**<8**慶大黴素>8<1**<1**阿米卡星>32<2**<2**妥布黴素>8<1**<1**呱拉西林/三唑巴坦>64<8**<8**環丙沙星>2<1**<1**亞胺培南>8<4**8*氨苄西林/舒巴坦>16<8**16*複方磺胺甲口惡唑>2<2**>2  氨苄西林>16  4**>16  頭孢噻吩>16<8**>16  頭孢泊肟>1<1**>1  頭孢呋肟>16<4**>16 

    *：中敏；  **：耐藥。    1：GeneRulerTM DNA Ladder；  2：肺炎克雷伯ATCC700603

    SHV引物PCR結果(陽性對照)；  3：大腸埃希菌ATCC25922

    SHV引物PCR結果(陰性對照)；  4～6：依次為接合子blaTEM、

    blaPER和blaOXA23引物PCR結果

    圖1    接合子的耐藥基因分型圖譜

    常接受靜脈插管、尿道插管和呼吸機輔助呼吸等侵入性治療，發生全身感染的機會增加；ICU院感率為其它科室的5～10倍［8］，感染耐藥菌的機會高2～3倍。

    AB是引起ICU感染爆發的一種機會致病菌。是院內菌血症、肺炎和尿路感染的一個重要源泉［9］。MDR AB的報道逐年增加，常對廣譜頭孢菌素和碳青黴烯類耐藥。

    本研究發現，南昌大學一附院ICU感染最常見的致病菌為銅綠假單胞菌，占16.27%，其次為金葡菌(15.66%)、AB(15.06%)和肺炎克雷伯菌(14.46%)等。痰液中分離得最多，占87.35%，這與ICU患者長期使用呼吸機輔助呼吸密切相關。萬古黴素為金葡菌感染治療的首選藥，與其它文獻報道一致；革蘭陰性菌耐藥率高，亞胺培南為治療肺炎克雷伯菌感染的首選藥；但AB對包括亞胺培南在內的13種常用抗生素均耐藥，對亞胺培南的耐藥率高於其它地區報道［8］。頭孢吡肟、慶大黴素、妥布黴素、環丙沙星和阿米卡星對治療銅綠假單胞菌感染效果好，嗜麥芽寡養單胞菌僅對環丙沙星敏感。

    目前國內、外在AB中分離的由質粒介導的β內酰胺酶主要為TEM1型，PER1型ESBLs和OXA23型碳青黴烯水解酶，且分離率極低。本研究在耐藥AB質粒上分離到TEM1型和PER1型兩種ESBLs基因，以及OXA23型碳青黴烯水解酶基因，有的同時帶blaTEM1、blaPER1和blaOXA23三種基因，應進一步監測其流行和耐藥情況，及時調整抗生素的使用方案，以防多重耐藥AB感染。

接合是不同種屬細菌間DNA自然傳遞的最常見方式，革蘭陰性杆菌耐藥率增長的最重要機製是帶耐藥基因的質粒通過接合播散。本研究證明了AB所帶的多重耐藥質粒可在不同種屬間通過接合的方式進行傳遞，並可穩定傳代，與Joshi等［10］報道相符。    以上結果提示，不同醫院的ICU，抗感染所使用的抗生素不同，常見致病菌的種類及耐藥譜也會有所不同，碳青黴烯為治療嚴重細菌感染的最有價值的方法，但碳青黴烯耐藥AB也逐漸增多；對ICU感染常見菌的種類、分布、耐藥性進行分析，研究MDR AB質粒上的耐藥基因型並確定其在不同種屬細菌間的可傳遞性，有助於指導ICU感染的治療。

作者：李蓉 李文林 石小玉 廖晚珍 徐小文 趙林《中國抗生素雜誌》

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