【摘要】 目的 探討銅綠假單胞菌細菌生物膜(biofilm，BF)形成發展過程中空間立體結構變化，以及BF形成過程中與其生物學行為之間的相互聯係。方法體外建立6h和1、3及6d等4個時間組銅綠假單胞菌PAO1菌株BF模型，通過綠色熒光蛋白(green fluorescence protein，GFP)標記，結合激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)攝取BF形成發展各階段不同層麵的圖片堆，經圖像結構分析軟件(image structure analyer，ISA)分析獲得PAO1菌株BF相關空間結構參數定量化數據。結果 ①CLSM結合GFP標記，實現了對PAO1菌株BF動態形成過程的觀察；②ISA軟件定量化分析顯示，隨著BF發展，厚度不斷增加，前3d增加程度(19.6μm)明顯大於後3d(6.1μm)，區域孔率(areal porosity，AP)、平均擴散距離(average diffusion distance，ADD)和結構熵(textural entropy，TE)在BF形成的6h和6d分別為：0.98±0.01和0.92±0.02，呈現下降趨勢；1.00±0.009和1.06±0.027，雖變化幅度不大，但亦呈現逐漸增加趨勢；0.7±0.08和4.3±0.09，呈明顯上升趨勢。結論 ISA程序可以表征PAO1菌株BF的空間結構特征，對細菌BF結構的定量化分析也有助於探索BF形成過程與其生物學行為之間的相互聯係。
【關鍵詞】 生物膜； 銅綠假單胞菌； 定量分析； 結構
ABSTRACT Objective To quantify the sequential development of biofilm spatial structure in biofilm process with Image Structure Analyer (ISA) software, which will provide assistant to further research on the biological behavior of biofilm. Methods P.aeruginosa PAO1 biofilm model in vitro was constructed on glass slice and biofilm development was monitored in different time intervals (6 hours, 1 day, 3 days and 6 days). The fluorescence images stack of different layer in biofilm model were obtained by confocal laser scanning microscopy (CLSM), based on fluorophores from PAO1 with green fluorescent protein (GFP) genetically tagged. Quantitative parameters describing biofilm spatial structure could be acquired after the image information was calculated by ISA software. Results ①The PAO1 biofilm process was investigated successfully by CLSM after genetically tagged with GFP. ②The quantitative data from ISA software showed that the thickness of biofilm accumulated during biofilm growth, the rate was more obvious during the first 3 days than the latter 3 days (19.6μm vs. 6.1μm); meanwhile the areal porosity (AP) decreased from 0.98±0.01 at 6h to 0.92±0.02 at 6d, the average diffusion distance (ADD) increased slightly from 1.00±0.009 at 6h to 1.06±0.027 at 6d; the textural entropy (TE) increased from 0.7±0.08 at 6h to 4.3±0.09 at 6d. Conclusions The ISA software could provide useful information of bacterial biofilm spatial structure in PAO1 biofilm process. Quantifying bacterial biofilm structure permitsed correlating biofilm development with biofilm performance.
KEY WORDS Biofilm; Pseudomonas aeruginosa; Quantitative analysis; Structure
長久以來，人們對細菌的認識停留在浮遊態水平上，但自然界中99%的細菌以生物膜(biofilm，BF)的形式存在。細菌BF是細菌為適應生存環境黏附惰性或活性材料表麵形成的一種與浮遊細胞相對應的生長方式，具有環境適應能力更強，抵抗吞噬細胞作用，逃避宿主免疫，尤其耐藥性極強等生物學特性，而BF的許多特性均與其特殊形態結構有關。銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa，Pa)是我國醫院和社區獲得性感染及重症監護病房感染的重要條件致病菌，近年來研究證明，該菌極易形成BF［1］，臨床上，有BF表型的Pa往往引起難以治愈的嚴重感染。以往研究多采用光鏡、掃描或透射電鏡等觀察細菌BF結構，但樣本在脫水、固定、染色等處理過程中易發生結構扭曲及關係改變。本實驗通過建立體外PaO1菌株BF模型，結合綠色熒光蛋白(GFP)標記技術，運用激光共聚焦顯微鏡(confocal laser scanning microscopy，CLSM)攝取BF發展成熟各階段不同層麵的圖像，所獲圖片堆經圖象結構分析(image structure analyer，ISA)軟件分析，獲得PAO1菌株BF發展過程相關空間結構變化的數據，以期實現對細菌BF的無損傷觀察，並對BF空間結構的定量化分析進行了初步探索。
1 材料和方法
1.1 試劑和菌株
銅綠假單胞菌PAO1菌株(本實驗室保存)，pGFPuv質粒(Clontech公司)，質粒DNA小量提取試劑盒(日本BioFlux公司)，限製型內切酶EcoRI和HindIII(寶生物公司)，ISA軟件(美國Montana州立大學Haluk Beyenal教授提供)。
(1)PAO1菌株電感受態製備 參考單誌英等［2］實驗方法，將過夜增菌的PAO1菌株轉接於50ml SOB培養基中，
(2)pGFPuv質粒轉化和轉化菌株篩選 感受態細胞100μl，質粒約50ng，加入預冷的
(3)轉化菌株中質粒提取和酶切電泳鑒定 挑取表達強綠色熒光的轉化菌株單菌落，接種LBroth培養液，
(4)pGFPuv轉化菌株建立BF模型 挑取GFP轉化PAO1菌株單菌落接種LBroth培養液，
1.2 激光共聚焦顯微鏡觀察
氬激光(488nm)激發，物鏡×20，每個模型由外(BF遊離的一麵)向內(BF和玻片相貼的一麵)逐層掃描(沿Z軸掃描)，每個標本掃描8～16張。
1.3 運用ISA軟件對PAO1菌株BF結構定量化分析
將上述獲得的各時間組模型圖片堆調入ISA3D軟件，確認圖片的完整性及順序後運行ISA及ISA3D命令，運行結果包括：①結構參數：如結構熵(textural entropy，TE)、結構能(energy，E)、均一性(homogeneity，H)；②平麵參數：區域孔率(areal porosity，AP)、平均擴散距離(average diffusion distance，ADD)、最大擴散距離(maximum diffusion distance，MDD)等指標；③其它參數：如生物量(biovolume，BV)、比表麵積(surface area between biomass and void，SA)、單位麵積生物膜體積(biomass volume to surface area ratio，V2SA)等［3］。輸出數據以EXCEL格式保存。
2 結果
2.1 GFP標記的PAO1菌株構建與發光表型觀察
通過電轉化方法對PAO1菌株進行了pGFPuv標記。轉化菌株自然光下即可見綠色熒光，在紫外燈下發出強綠色熒光；熒光顯微鏡下，轉化菌株菌體發出明亮的綠色熒光，細菌形態呈短棒狀，提示pGFPuv已經成功轉入了PAO1菌株中，該轉化菌株可以作為BF空間結構定量化分析研究的模式菌。
2.2 轉化菌株質粒提取鑒定及雙酶切鑒定
轉化菌株抽提質粒後，電泳結果顯示在2000和3500bp之間有一條約3300bp帶，條帶與質粒大小吻合。提取的質粒進行EcoRI和HindIII雙酶切，電泳顯示在2000和3500bp之間有一條約2500bp帶，在500和1000bp之間有一條約800bp帶，與預期結果吻合，提示pGFPuv已成功轉入PAO1菌株，並以遊離質粒形式表達。
2.3 CLSM觀察GFP標記BF模型
6h左右，PAO1已經在玻片上黏附聚集，發出綠色熒光；1d組模型多為綠色熒光，細菌呈微菌落聚集，已具有一定厚度；隨著時間延長，BF變厚，3d組及6d組模型肉眼可見一層灰白色膜狀物平鋪於玻片上，鏡下可見大片狀BF，細菌密集，層疊如積雲狀，棉絮樣，具備複雜空間結構，細菌之間有許多非綠色的黑色區域，呈管道或泡狀。
2.4 ISA軟件結構定量化分析
對各時間組模型的平均厚度、AP、ADD及TE進行統計，隨著培養時間延長，各時間組PAO1菌株BF的平均厚度不斷增加，增加程度在前3d比較明顯，每個時間組之間增加10μm以上，3d後增加速度減慢，3d組與6d組BF的平均厚度僅增加了6μm(表1)；隨著培養時間延長，各時間組模型的AP值呈下降趨勢，由最初的0.98下降到0.92；TE值由最初的0.7上升到4.3，增幅接近6倍；ADD值雖然變化幅度不大，但是呈上升趨勢(表1)。表1 各時間組PAO1菌株BF的平均厚度、AP、ADD及TE值
3 討論
細菌BF是一個三維立體空間結構的生態係，是一個具有高度結構性、協調性和功能性的組織群體，BF結構的維持對BF生物學行為具有重要意義。深入認識BF的結構特點，不能停留在某一平麵的形態描述，還需要對BF的空間結構展開定量化分析。由於報道基因中常用的綠色熒光蛋白(GFP)的基因具有基因小、性質穩定、對細胞安全等優點，本實驗運用電轉化方法，成功地將pGFPuv轉入PAO1中，建立體外PAO1菌株BF模型，運用CLSM觀察以保證細菌BF結構的完整性，連續檢測其在玻片表麵定植形成BF的過程，結合計算機圖像處理分析係統，對BF結構進行定量化分析。
BF形成發展是一個動態過程，生長周期一般分為5個階段：最初的定植階段、不可逆黏附階段、結構分化階段、發展成熟階段和解聚再定植階段［4］。本實驗通過CLSM連續動態觀察PAO1菌株BF形成，基本反映了這樣一個過程：6h左右PAO1菌株開始在玻片表麵黏附聚集，1d左右初步形成BF，3d時BF基本形成，具備三維結構，此後BF逐漸發展達到一個平衡，這與文獻報道基本一致［5］。隨著培養時間延長，BF厚度逐漸增加，但趨勢漸緩，可能與BF營養滲透屏障有關。
本實驗還采用ISA軟件獲得了BF空間結構參數的定量化數據，實現了對BF基礎結構特征的定量化分析。該軟件由美國Montana州立大學的生物膜工程中心2000年開發，采用自動定閾係統［6］，降低了圖片處理中主觀因素的影響，對BF的二維和三維結構進行更多參數的測定和比較。
ISA提供厚度參數顯示，GFP標記的BF模型平均厚度在前3d內增長速度明顯快於後3d，提示BF生長速度的不均一性。細菌黏附後初期，BF迅速增厚，但隨著時間延長，BF厚度增加趨勢減慢，其原因除與營養限製有關外，也可能是BF增加到一定厚度後，為保證底層細菌獲得一定的營養物質而維持自身結構，對自身發出密度感應(quorum sensing，QS)信號產生反應，達到平衡狀態。
本實驗對BF的觀察中還發現BF並非一層單純的致密膜，其內部存在很多黑色相互交通的間隙及孔道，Stoodley等［7］認為這些大、小不一的間隙和通道是BF結構的重要組成部分，其中充滿了胞外多糖和蛋白質等營養物質，與深層BF中的細菌生長關係密切。Wood等［8］在牙菌斑BF也發現類似的間隙和通道貫穿於整個BF之中，其功能類似初級循環係統，活菌緊緊圍繞在這些孔和通道的周圍，保證營養的獲取和排除代謝廢物。此外，BF還可以借這些通道來感知QS信號。BF這種結構特點決定BF具有一個能適應多種理化變化的內環境。
ISA軟件通過區域孔率(AP)和平均擴散距離(ADD)這兩個參數，客觀反映BF結構發展過程中間隙孔道及營養物質供應距離變化。本實驗發現隨著培養時間延長，BF厚度逐漸增加，AP逐漸減低，ADD逐漸增加，提示BF逐漸發展，細菌聚集越來越致密，BF結構中間隙及通道的孔徑和數目減少，相應營養物質的供應距離增加，細菌物質代謝受到一定限製而將逐漸發展達到一個相對穩態。
BF不僅在結構上存在多樣、開放、不均一性特點，而且環境中營養物質、代謝產物、信號分子等物質在BF各個層麵也呈現不均一性，使得各層BF菌生理活性及耐藥水平也表現出不均一性，最終控製了BF的發展成熟和整體生物學行為。這種不均一性可能是BF的“保護效應(insurance effects)”，是細菌生存的重要策略［9］，它使BF無論受到作用於那個代謝環節的抗微生物因子的攻擊，都會有一些細菌存活“重建家園”。ISA軟件通過TE參數反映了BF結構發展過程中這種不均一性的變化。實驗結果顯示隨著培養時間延長，TE值逐漸增大，說明在一定範圍內，伴隨BF發展成熟，BF的不均一度愈來愈強，結構越來越複雜，對外界環境變化的抵抗能力也加強。
ISA軟件具有較強的分析功能，根據美國Montana州立大學生物膜工程中心的研究積累發現，平麵參數中以AP、ADD最有實用價值，這兩個參數能直觀地描述BF的結構特點及營養供應情況；而結構參數中以TE最有實用價值，可用於不同BF的比較分析。ISA還能提供FD、MDD、AVRL、AHRL、E、H等參數，但是它們與BF發展的潛在關係尚不明確，有待於進一步驗證［10］。
本實驗還利用CLSM的三維重建功能對部分模型進行了三維重建，得到了PAO1菌株BF的三維立體圖像，圖像反映BF是一個多樣，開放、不均一的結構，與ISA軟件分析結果一致。
需要說明，外源基因表達蛋白質，需消耗宿主細胞的營養物、能量及相關酶等，是宿主細胞的額外負組，可導致重組質粒穩定性降低［11］，而BF中底層細菌營養物質最差，可能影響了GFP的充分表達。Leff等［12］亦報道，在低營養條件下的河水中，GFP質粒可能丟失或不表達。
因此，本實驗通過體外建立PAO1菌株BF模型，結合CSLM成功實現了對PAO1菌株BF的原位、動態觀察，並利用ISA軟件對獲得的圖片堆進行BF空間結構特點的定量分析，比較客觀地說明BF形成過程中空間結構變化，為進一步深入認識細菌BF結構及有效控製細菌BF形成提供新的研究思路和技術平台，這對於臨床上控製生物材料相關性感染具有重大意義。
作者：陳波曼 餘加林 劉官信 胡琳燕 李芳 楊華《中國抗生素雜誌》
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