多重耐藥大腸埃希菌16S rRNA甲基化酶、氨基糖苷類修飾酶基因研究

【摘要】  目的 了解多重耐藥大腸埃希菌(ECO)氨基糖苷類藥物耐藥機製。方法采用PCR檢測20株多重耐藥ECO菌11種16S rRNA甲基化酶和氨基糖苷類修飾酶基因。結果 1株檢出16S rRNA甲基化酶基因(5.0%)，並為新亞型；16株檢出氨基糖苷類修飾酶基因(80.0%)。15號株rmtB基因測得序列翻譯成氨基酸序列與美國核酸庫(GenBank)已登錄的rmtB氨基酸不同，為新亞型。結論 本組多重耐藥ECO菌氨基糖苷類耐藥機製與產16S rRNA甲基化酶和產氨基糖苷類修飾酶相關。多重耐藥ECO菌存在新的氨基糖苷類藥物耐藥機製。

【關鍵詞】  大腸埃希菌； 16S rRNA甲基化酶；氨基糖苷類修飾酶

    ABSTRACT  Objective  To investigate mechanism of aminoglycoside resistance in multidrugresistant Escherichia coli.  Methods  The genes of 11 kinds 16S rRNA methylase and aminoglycosidemodifying enzymes were detected by polymerase chain reaction (PCR).  Results  In 20 strains, 1 strain carried 16SrRNA methylase gene (rmtB), 16 strains were positive for the genes of aminoglycosidemodifying enzymes. There were changes of aminoacids in the sequence of RmtB of No.15. A significant difference was found from the rest that landed in GenBank, which identified itself as new subtype.  Conclusion  The aminoglycoside resistance mechanism of the Escherichia coli was closely related with 16S rRNA methylase and aminoglycosidemodifying enzymes. The new mechanism of aminoglycoside resistance was discoved in multidrugresistant strains of Escherichia coli.

    KEY WORDS  Escherichia coli;  16S rRNA methylase;  Aminoglycosidemodifying enzymes

      大腸埃希菌(ECO)是條件致病菌，對β內酰胺類和氨基糖苷類在內的常用抗菌藥物呈多重耐藥性。有關ECO菌耐藥機製研究，國內報道β內酰胺類耐藥機製較多，報道氨基糖苷類耐藥機製較少，並僅限於6種氨基糖苷類修飾酶基因存在情況［1～4］。近年來，國外學者發現了氨基糖苷類耐藥新機製——16S rRNA甲基化酶(編碼基因為rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和armA)［5～8］。為盡可能了解淮安市第一人民醫院ECO菌臨床分離多重耐藥株氨基糖苷類藥物各種耐藥相關基因存在狀況，我們檢測了16S rRNA甲基化酶與氨基糖苷類修飾酶基因rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、armA、aac(3)I、aac(3)II、aac(6′)Ib、aac(6′)II、ant(3")I和ant(2")I，現報告如下。

    1  材料與方法

    1.1  菌株來源

    20株ECO菌株均分離自2007年1～7月間淮安市第一人民醫院住院患者標本。標本來源分別為尿液7株、痰液5株、血液5株、膿液3株；患者年齡2～75歲，男7例、女13例。全部菌株均使用VITEK32全自動微生物鑒定係統鑒定菌種。標準菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

    1.2  抗菌藥物敏感性試驗

    用KB法測定18種抗菌藥物的敏感性。根據美國CLSI 2006年版標準進行敏感性判斷。頭孢呱酮/舒巴坦參照頭孢呱酮。20株多藥耐藥臨床分離ECO菌對18種抗菌藥物的敏感性見表1。

    1.4  細菌處理

    挑純培養菌落置0.5ml離心管內(內預置200ng/ml蛋白酶K溶液200μl)，56℃水浴2h，改95℃水浴10min，加入Chelex100 40μl，離心(15000r/min)30s，上清液即為基因檢測的模板液，-20℃冰箱保存備用。

    1.5  基因檢測

    全部采用PCR法，靶基因引物序列和目的產物長度見表2。各種靶基因PCR擴增體係均為：每反應體係P1、P2引物各0.5μmmol/L， dNTPs各200表1      20株ECO菌18種抗菌藥物的敏感性表2   靶基因PCR引物序列總反應體積20μl(其中模板液5μl)。PCR擴增產物>500bp熱循環參數均為：93℃預變性2min，然後93℃　60s→55℃　60s→72℃　60s，循環35周期，最後一個72℃延長至5min。PCR擴增產物<500bp熱循環參數均為：93℃預變性2min，然後93℃　30s→55℃　30s→72℃　60s，循環35周期，最後一個72℃延長至5min。擴增產物作2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠電泳成像儀下觀察，並紀錄結果。耐藥基因檢測試劑盒、靶基因PCR引物序列和陽性對照DNA由無錫市克隆遺傳技術研究所提供。

    1.6  陽性基因測序

    PCR直接全自動熒光法(在美國ABI公司3730型儀上進行)。

    2  結果

    20株ECO菌中rmtB基因陽性1株(5.0%)；aac(3)II、aac(6′)Ib、ant(3")I基因陽性分別為15株(75.0%)、8株(40.0%)、3株(15.0%)，共有16株檢出氨基糖苷類修飾酶基因(80.0%)。20株ECO菌對氨基糖苷類藥物耐藥的各種相關基因存在狀況見表3。15號株測得rmtBDNA序列翻譯成氨基酸序列與美國核酸庫已登錄的rmtB氨基酸序列比較(Escherichia coli，登錄號：ABW87619)，氨基酸序列98%相同，能判斷為新亞型，已命名為rmtBlike並登錄於美國核酸庫(登錄號：EU409593)。圖1為15號株氨基酸序列比較圖。

    3  討論

    氨基糖苷類藥物自20世紀40年代首次發現以來，因其抗菌譜廣、療效卓越，在醫學臨床和畜牧獸醫業得到廣泛應用。但由於泛用和過度使用氨基糖苷類藥物耐藥問題隨之凸現，細菌對該類藥物耐藥是通過表316S rRNA甲基化酶、氨基糖苷類修飾酶15號株測得rmtB DNA序列翻譯成氨基酸序列與美國核酸庫已登錄的rmtB氨基酸序列比較產氨基糖苷類修飾酶、細菌16S rRNA甲基化酶(編碼基因為rmtA、rmtB、rmtC、rmtD和armA)和氨基糖苷類藥物作用靶位16S rRNA基因(16S rDNA)突變或核糖體蛋白編碼基因突變所致以及細菌藥物外排泵表達增強所致［9，10］，其中產氨基糖苷類修飾酶為主要原因。氨基糖苷類修飾酶按功能可分成乙酰轉移酶(AAC)、磷酸轉移酶(APH)、核苷轉移酶(ANT)［舊稱腺苷轉移酶(AAD)］三類，目前已發現的有30餘種。本研究20株ECO菌株中檢出rmtB 16S rRNA甲基化酶基因；檢出aac(3)II、aac(6′)Ib和ant(3")I三種氨基糖苷類修飾酶基因，並以aac(3)II和aac(6′)Ib為主。

本組13株慶大黴素和/或阿米卡星耐藥菌均檢出1種以上氨基糖苷類修飾酶基因；1株慶大黴素和阿米卡星黴素均敏感者未檢出氨基糖苷類修飾酶基因；另有3株慶大黴素和/或阿米卡星耐藥者均未檢出氨基糖苷類修飾酶基因，原因可能是藥物作用靶位16SrRNA基因(16S rDNA)突變或核糖體蛋白編碼基因突變所致或細菌藥物外排泵表達增強所致。

    過去，藥物學家通過改造老的氨基糖苷類藥物的結構改善產氨基糖苷類修飾酶細菌的抗菌效能［11，12］，如在卡那黴素分子中引入保護基團以免修飾酶的修飾(如阿米卡星)；或是去除易被修飾酶修飾的基團(如地貝卡星)；或是兩者同時采用(如阿貝卡星，阿貝卡星能拮抗大多數的修飾酶)。現在發現16S rRNA甲基化酶在細菌間快速傳播將堵住通過改造老的氨基糖苷類藥物的結構以拮抗修飾酶和提高抗菌作用開發新藥的路子。因此16S rRNA基因甲基化酶所致的氨基糖苷類藥物耐藥應引起國內同行的足夠關注。

    16S rRNA甲基化酶在東亞(日本、韓國、我國台灣)、歐洲和南美均有報道［13］。最近，我國動物醫學專家報道了從豬分離到的陰溝腸杆菌中發現的rmtB［14］。日前我國從多藥耐藥鮑曼不動杆菌中查出armA型16S rRNA甲基化酶［15］，本文從ECO菌查出rmtB型16S rRNA甲基化酶為國內首次，並為新亞型。我國ECO菌臨床連續分離株16S rRNA甲基化酶存在狀況值得深入研究。

研究提示，本組ECO菌氨基糖苷類耐藥機製與產16S rRNA甲基化酶和產氨基糖苷類修飾酶相關。當然仍不能排除同時伴有氨基糖苷類作用靶位16S rRNA基因突變或核糖體蛋白編碼基因突變以及存在多藥外排機製。

作者：林寧 孫海平 糜祖煌《中國抗生素雜誌》

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