【摘要】 目的 了解臨床分離的大腸埃希菌耐藥性和複方磺胺甲口惡唑(SMZ/TMP)耐藥相關基因存在狀況。方法 測定臨床連續分離的60株大腸埃希菌對19種抗菌藥物的敏感性，采用聚合酶鏈反應(PCR)檢測SMZ/TMP耐藥相關基因(sul1、dfrA1、dfrA17)。結果 60株中sul1、dfrA1、dfrA17基因陽性分別為34株(56.7%)、1株(1.7%)、35株(58.3%)。結論 臨床分離的大腸埃希菌多重耐藥嚴重；複方磺胺甲口惡唑耐藥相關基因攜帶率高。
【關鍵詞】 大腸埃希菌； 複方磺胺甲口惡唑； 耐藥基因
ABSTRACT Objective To investigate the drug resistance and drug resistancerelated trimethoprimsulfamethoxazole genes in Excherichia coli. Method Microdilution tests were performed to detect susceptibility of 60 strains of Escherichia coli to 19 antimicrobial agents and drug resistancerelated trimethoprimsulfamethoxazole were detected by PCR. Result The positive rates of sul1, dfrA1 and dfrA17 genes in 60 clinical strains of Escherichia coli were 56.7%, 1.7%, 58.3%, respectively. Conclusions There are multipledrug resistance and high positive rate of drug resistancerelated trimethoprimsulfamethoxazde genes in Escherichia coli isolated from the hospital.
KEY WORDS Escherichia coli; Trimethoprimsulfamethoxazole; Resistant genes
多年來，大腸埃希菌(Escherichia coli，EC)一直是醫院感染的重要病原菌之一。EC菌對β內酰胺類和氨基糖苷類在內的常用抗菌藥物出現多重耐藥性，相關耐藥基因研究已有報道。經檢索國內尚無EC菌的複方磺胺甲口惡唑(SMZ/TMP)耐藥相關基因報道。我們對60株連續分離株EC菌進行了藥敏表型檢測，並進行了SMZ/TMP耐藥相關基因sul1、dfrA1、dfrA17檢測，現報道如下。
1 材料與方法
1.1 菌株來源 60株EC菌均分離自2006年08月～2006年12月間麗水市人民醫院住院患者臨床標本，其中痰液10例，尿液24例，血液2例，分泌物24例(膿液15例、腹水4例、引流液3例、咽拭子2例)。全部菌株用BioMerieux ATB細菌鑒定儀鑒定菌種。標準菌株為大腸埃希菌ATCC25922和銅綠假單胞菌ATCC27853。
1.2 抗菌藥物敏感性試驗
用微量肉湯稀釋法測定19種抗菌藥物的敏感性，並根據美國CLSI 2006年版要求進行敏感性判斷。
1.3 細菌處理 挑純培養菌落置入0.5ml離心管內(內預置200ng/ml蛋白酶K溶液200μl)，
1.4 基因檢測
用聚合酶鏈反應法(PCR)進行檢測。PCR引物序列見表1。PCR擴增體係為：每反應體係P1、P2引物各0.5μmol，dNTPs各200mmol，KCl 10mmol，(NH4)2SO4 8mmol，MgCl2 2mmol，TrisHCl(pH9.0) 10mmol，NP40 0.5%，BSA 0.02%(wt/vol)，Taq DNA pol 1U；總反應體積20μl(其中模板液5μl)。熱循環參數為：
2 結果
2.1 藥敏試驗結果
60株EC菌連續分離株對亞胺培南和美羅培南敏感。對頭孢他啶、阿莫西林/克拉維酸、頭孢西丁、阿米卡星、頭孢呱酮/舒巴坦和呱拉西林/三唑巴坦等6種抗菌藥物的敏感率在53.3%～95%；對頭孢噻肟、頭孢呋辛、妥布黴素、慶大黴素、環丙沙星、呱拉西林、阿莫西林和替卡西林等8種抗菌藥物的耐藥率在50%～90%。對複方磺胺甲口惡唑的耐藥率為66.7%。
2.2 sul1、dfrA1、dfrA17基因
sul1、dfrA1、dfrA17基因陽性率分別為56.7%(34/60)、1.7%(1/60)、58.3%(35/60)。有35株檢出dfrA基因(58.3%)，40株檢出sul和(或)dfrA基因(66.7%)。圖1為sul1基因PCR產物電泳圖。dfrA17基因PCR產物經測序與美國GenBank核酸數據庫中已登錄的dfrA17基因序列完全一致。
3 討論
EC菌廣泛分布於自然界、健康人的皮膚、腸道和呼吸道。正常情況下，EC菌並不感染人體的任何組織，但當人體免疫力降低、長期大量使用廣譜抗菌藥物或創傷性醫療操作等情況下易引起內源性感染。EC菌所致感染中以泌尿道感染、呼吸道感染、菌血症等最常見。
複方磺胺甲口惡唑為磺胺甲基異口惡唑(sulfamethoxazole，SMZ)與甲氧苄胺嘧啶(trimethoprim，TMP)的複合製劑，磺胺的抑菌機製為與化學結構相似的對氨苯甲酸(PABA)競爭二氫葉酸合成酶(DHPS)，使二氫葉酸合成減少；甲氧苄胺嘧啶能抑製二氫葉酸還原酶(DHFS)，使四氫葉酸的生成受阻。磺胺藥與甲氧苄胺嘧啶合用後，分別作用於細菌葉酸合成的不同環節，因而有協同作用［1］。近年來，對細菌的可移動性遺傳元件研究發現，I類整合子的耐藥基因盒中常攜帶二氫葉酸合成酶的編碼基因sul1，有些同時還攜帶二氫葉酸還原酶的編碼基因dfrA(早期文獻中以dhfr表示)［2～4］。細菌額外獲得sul1基因，所表達的二氫葉酸合成酶抵消了磺胺與PABA競爭性抑製作用，導致細菌耐磺胺。細菌額外獲得dfrA基因，所表達的二氫葉酸還原酶補充了甲氧苄胺嘧啶靶位酶，導致細菌耐甲氧苄胺嘧啶。
為了解EC菌複方磺胺甲口惡唑耐藥相關基因存在狀況，我們根據美國GenBank核酸數據庫中已發布的腸杆菌I類整合子基因序列，自行設計了sul1、dfrA1、dfrA17基因PCR擴增引物。結果顯示有40株檢出sul和(或)dfrA基因(66.7%)，表型與基因型基本相符。對臨床連續分離EC菌的複方磺胺甲口惡唑(SMZ/TMP)耐藥相關基因的專題研究國內為首次報道。
1996年，在O139群霍亂弧菌中發現一種整合性接合元件，該元件整合於細菌染色體上(長約100kbp)編碼對磺胺甲基異口惡唑與甲氧苄胺嘧啶的抗性，被稱為SXT元件［5］。SXT元件不僅存在於霍亂弧菌中，其它細菌內也有發現［6］。EC菌是否存在SXT元件需要進一步研究。
作者：王偉 糜祖煌 毛劍鋒 徐偉珍 《中國抗生素雜誌》
【參考文獻】
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