多重耐藥銅綠假單胞菌β－內酰胺類相關耐藥基因研究

【摘要】 目的 調查我院2005年臨床分離多重耐藥銅綠假單胞菌(PA)的耐藥性分析並探討其耐藥基因的存在狀況。方法 對31株臨床分離的銅綠假單胞菌用紙片擴散法檢測其藥敏表型，采用聚合酶鏈反應(PCR)法檢測β-內酰胺酶編碼基因和外膜通道蛋白OprD2基因，並與相關藥敏表型比較。結果 31株銅綠假單胞菌對16種抗菌藥物的耐藥率為48．4%~100%；β-內酰胺酶編碼基因PER、VIM、CARB、IMP、TEM、OXA-10的檢出率分別為6．4%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%，未檢出GES、SHV、VER基因，31株外膜通道蛋白OprD2基因缺失，檢出率為100%。結論 本院多重耐藥銅綠假單胞菌對β-內酰胺酶類抗生素的耐藥主要與外膜通道蛋白OprD2基因缺失有關。

　　【關鍵詞】銅綠假單胞菌；多重耐藥；β-內酰胺酶；聚合酶鏈反應；基因型

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　　【Abstract】 Objective To survey the distribution of aminoglycoside-modifying enzyme genes in multidrug-resistant pseudomonas aeruginosa isolated in our hospital in 2005．Methods The antibiotic susceptibility of 31 different antibiotics of P.aeruginosa was tested by K-B method，and 31 multi-drug resistant strains were screened;β-lactamase genes and the outer membrane protein OprD2 gene were detected by polymerase chain reaction(PCR).Results Resistant rates of 31 strains of P.aeruginas against 16 kinds of antibiotic ranged from 48．4%to 100%;the detection rate of β-lactamase gene PER，VIM，DHA，IMP，TEM and OXA-10 was 6．4%，3．2%，3．2%，3．2%，3．2%and 3．2%respectively，and none of the 31 strains possessed genes of GES，SHV and VER，31 isolate of PA lost the outer membrane protein OprD2 gene.Conclusion Resistance to β-lactam compounds in P.aeruginas of our hospital is related to lost the outer membrane protein.

　　【Key words】Pseudomonas aeruginosa; Multidrug resistance; β-Lactamases; Polymerase chain reaction; Genes

　　

　　銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)是一種重要的條件致病菌，常常引起呼吸道感染、菌血症、肺炎、泌尿係統感染、燒傷感染和囊性纖維化繼發感染等多種疾病。2002年全國細菌耐藥性監測網調查顯示：PA的分離率為10．3%，僅次於大腸埃希菌而居第二位^[1]。由於臨床上抗生素的大量使用，銅綠假單胞菌呈現出天然或獲得性多重耐藥性(multidrug resistance，MDR)，給治療造成困難。近年來，銅綠假單胞菌對3、4代頭孢和亞胺培南在內的多種β內酰胺類抗生素及氨基糖苷類抗生素耐藥率一直處於一個比較高的水平，並呈現逐年上升的趨勢^[1-3]。為了解臨床分離多重耐藥的PA中耐藥情況，收集了本院2005年1~12月臨床分離的31株PA，對其進行耐藥性的檢測，並采用分子生物學技術檢測其耐藥相關基因，結果報告如下。

　　1 材料

　　1．1 菌株 來源於本院2005年1~12月臨床分離的多重耐藥銅綠假單胞菌(MDRP)31株。所有標本均采用法國生物梅裏埃公司細菌鑒定儀鑒定菌種。

　　1．2 質控菌株 大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853均購自衛生部臨床檢驗中心。

　　1．3 MH培養基 采用英國Oxoid公司產品。

　　1．4 抗生素及藥敏紙片頭孢他啶(30 μg/片，CAZ)、頭孢曲鬆(30 μg/片，CRO)、亞胺培南(10 μg/片，IMP)、克拉維酸(2 mmol/L，CA)、氯唑西林(2 mmol/L)、美羅培南(10 μg/片，MER)、2-巰基丙酸紙片均購自英國Oxoid公司。

　　1．5 微生物鑒定係統 VITEK-32法國生物梅裏埃公司產品。

　　1．6 儀器 DNA擴增儀為美國PE公司產品。

　　1．7 PCR檢測試劑盒由無錫市克隆遺傳技術研究所提供。

　　2 方法

　　2．1 細菌培養、鑒定和保存細菌培養根據臨床檢驗操作規程按常規方法進行，采用VITEK-32全自動微生物鑒定係統鑒定結果；將細菌接種於半固體培養基中，37℃培養24 h後置-80℃冰箱保存，以備進行分子學檢測。

　　2．2 抗生素敏感試驗采用紙片擴散法(K-B法)，結果根據美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)2004年版標準進行判斷。

　　2．3 PCR擴增模板製備挑取菌落置入含100 μl生理鹽水的0．5 ml離心管內，15 000轉/min離心5 min，去上清。加0．05%非離子去汙劑NP40 50 μl、200 ng/ml的蛋白酶K 2 μl混勻，55℃水浴1 h，然後95℃水浴5 min，最後10 000轉/min離心30 s，取上清做PCR擴增的模板。

　　2．4 基因檢測 均為PCR法。PCR擴增產物>500bp熱循環參數均為：93℃預變性2 min，然後93℃60 s→55℃60 s→72℃60 s，循環35個周期，最後一個72℃延長至5 min，其餘均為：93℃預變性2 min，然後93℃30 s→55℃30 s→72℃60 s，循環35個周期，最後一個72℃延長至5 min。各種靶基因的目的產物長度見表1。 　　

　　2．5 擴增產物檢測 擴增產物在1．5%瓊脂糖凝膠(含0．5 μg/ml溴化乙錠)120 V電泳30~40 min，全自動凝膠圖像成像儀觀察，出現與陽性模板分子量相同的條帶即為陽性，PCR檢測陽性對照DNA，由無錫市克隆遺傳技術研究所微生物DNA收集與保存室提供，擴增條件同上。

3 結果

　　3．1 藥敏試驗結果 31株銅綠假單胞菌對16種抗菌藥物的藥敏率見表2。 　　

　　3．2 基因檢測結果 β內酰胺酶編碼基因PER、VIM、CARB、IMP、TEM、OXA-10的檢出率分別為6．4%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%、3．2%，未檢出GES、SHV、VER基因，31株外膜通道蛋白OprD2基因缺失，檢出率為100%。

　 　

　　

　　4 討論

　　研究發現，PA對β內酰胺類抗生素存在多種耐藥機製，如外膜滲透性降低、泵出機製、由染色體編碼持續高產AmpC酶、產超廣譜β內酰胺酶^[4]以及能水解卡巴培能碳氫酶烯的金屬酶等。IMP是目前用於治療革蘭陰性杆菌感染具有最強抑菌效能的抗生素，對產ESBLs及AmpC酶的革蘭陰性杆菌均有效。IMP耐藥的PA在臨床上具有更大的危險性^[5]。

　　近年來隨著研究的深入，國內外學者在PA菌臨床分離株中發現了多種β內酰胺酶和碳青黴烯酶基因如TEM^[6]、SHV^[6，7]、OXA^[8]、VEB-1、PER^[8，9]、GES、持續高產AmpC酶、IMP^[10]、VIM^[11]、SPM^[12]等。在我國上海、杭州、石家莊、溫州相繼發現了VEB-1、OXA-10、IMP、PER-1、TEM-1、SHV基因^[6，8，10]。這些基因所表達的產物可以水解青黴素類、頭孢菌素類、單酰胺類和碳青黴烯類抗生素。

　　本組菌株中，表型耐亞胺培南的共31株(占100%)，其中外膜通道蛋白OprD2基因缺失為100%；VIM、IPM基因各發現1株，各占3．2%。PA對亞胺培南耐藥的主要原因為產IMP、VIM、SPM、GIM型金屬β-內酰胺酶、GES-2型β-內酰胺酶和外膜蛋白OprD2缺失等。β內酰胺類抗生素對PA的作用靶位是細菌內膜上的PBP2，該類藥物要達到其作用靶位必須首先經過外膜通道進入周漿間隙。如果菌株外膜蛋白通道減少或缺失，藥物難以到達其作用靶位，細菌將產生耐藥。因此，OprD2被認為是亞胺培南擴散的通道^[11]。VIM、IMP是金屬β-內酰胺酶，可快速水解青黴素類、頭孢菌素類和碳青酶烯類抗菌藥物。通過本組實驗研究可以表明PA對亞胺培南耐藥的主要原因是特異性通道OprD2缺失引起外膜通透性降低，從而阻礙抗菌藥物進入菌體內到達細菌作用靶位。

　　OXA、TEM、SHV、PER、GES陽性均可引起PA對β內酰胺酶類抗菌藥物的廣泛耐藥。本組菌株中PER的陽性率為6．4%，TEM、OXA-10的陽性率為3．2%，而GES、SHV基因未檢出，這些基因的陽性率與國內其他地區的檢測結果有差別^[6，8，10]。導致此種結果出現的原因應與本地區抗菌藥物的使用情況有密切關係。

　　總之，PA的耐藥機製極為複雜，它對某一類抗菌藥物的耐藥往往不是由單一因素造成，而常是幾種機製協同作用的結果；它對不同抗菌藥物的耐藥機製也不完全相同，並不斷有新的耐藥機製出現。即使是同一種菌不同地區、不同時期其耐藥性和耐藥基因狀況也不相同。本實驗結果證明聊城地區的PA對各類抗菌藥物均有不同程度的耐藥性，且耐藥基因陽性率較有報道的國內其他地區高。OprD2基因缺失應該是本組菌株耐藥的主要原因，此情況應引起臨床醫生和院內感染科的高度重視，但也不排除同時存在其他耐藥機製的可能，有待進一步研究。

　　作者：李豔華　高恒強　李鵬　張延強《中國實用醫藥》

　　參 考 文 獻

　　［1］ 馬越，李景雲，張新妹，等.2002年臨床常見細菌耐藥性監測.中華檢驗醫學雜誌，2004，27（1）：38-45.［2］ 王輝，陳民鈞.1994~2001年中國重症監護病房非發酵糖細菌的耐藥變遷.中華醫學雜誌,2003，83（5）：385-390.

　　［3］ 段建春，呂曉菊.革蘭氏陰性菌對氨基糖苷類抗生素耐藥機製的研究進展.中國抗生素雜誌,2004，29（6）：329-331.

　　［4］ 蔣曉飛，倪語星.銅綠假單胞菌產生的超廣譜β-內酰胺酶.中華微生物學和免疫學雜誌，2001，21（S1）：6-8.

　　［5］ 李智山，鄧三季，楊燕，等.綠膿假單胞菌β-內酰胺酶類耐藥基因研究.中華檢驗醫學雜誌，2005，28（10）：1030-1033.

　　［6］ 李超，周鐵麗，馬鵬鵬，等.SHV、TEM基因介導的銅綠假單胞菌產超廣譜β-內酰胺酶的檢測.現代實用醫學，2003，15(10)：615-617.

　　［7］ Poirel L，Lebessi E，Castro M，et al.Nosocomial outbreak of extended-spectrum beta-lactamase SHV-5-producing isolates of Pseudomonas aeruginosa in Athens，Greece.Antimicrob Agents Chemother，2004,48:2277-2279.

　　［8］ 侯天文，尹曉林，陳興，等.綠膿假單胞菌超廣譜β-內酰胺酶基因型分布.中華檢驗醫學雜誌，2003，26(9)：465-548.

　　［9］ Pagani L，Mantengoli E，Migliavacca R，et al.Multifocal detection of multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa producing the PER-1 extended-spectrum beta-lactamase in Northern Italy.J Clin Microbiol，2004,42:2523-2529.

　　［10］ 呂火祥，孫明洪，劉建棟，等.協同法過篩檢測金屬β-內酰胺酶的研究.中華檢驗醫學雜誌，2002，25(4)：232-235.

　　［11］ Ochs M M，McCusker M P，Bains M，et al.Negative regulation of the Pseudomonas aeruginosa outer membrane porin OprD selective for imipenem and basic amino acids.Antimicrob Agents Chemother,1999,43:1085-1090.

　　［12］ Poirel L，Magalhaes M，Lopes M，et al.Molecular analysis of metallo-beta-lactamase gene bla(SPM-1)-surrounding sequences from disseminated Pseudomonas aeruginosa isolates in Recife，Brazil.Antimicrob Agents Chemother，2004,48:1406-1409.