【摘要】 目的 研究白色念珠菌（Candida Albicans）細胞壁不同溶解性的β-葡聚糖（β-glucan）對環磷酰胺（cyclophosphamide，endoxan，cytoxan，CTX）所致小鼠外周血白細胞減少的回升作用。方法 采用CTX所致的小鼠外周血白細胞減少模型，研究白色念珠菌細胞壁β-葡聚糖對小鼠外周血白細胞數的影響。結果 三種溶解性的白色念珠菌細胞壁β-葡聚糖均能升高小鼠外周血白細胞、中性粒細胞和單核細胞數。各組小鼠脾髒指數增加，脾髒、骨髓巨核細胞係增生。不溶性的β-葡聚糖作用更明顯。結論 白色念珠菌β-葡聚糖尤其是不溶性β-葡聚糖對CTX所致的白細胞減少有回升作用，是一種很有前途的免疫調節劑。
【關鍵詞】 白色念珠菌；β-葡聚糖；生物學活性；提取分析；免疫藥理作用
【Abstract】 Objective To study the pharmacological effect of the basic β-glucan，acidic β-glucan and insoluble β-glucan extracts of Candida albicans on the leukocytopoiesis-promoting in the leukopenia mice.Methods Mice of each group except the untreated control group were administered cyclophosphamide intraperitoneally ［100 mg/(kg·d) for three days］ to develop leucopenia.The experimental group were administered three kinds of Candida albicans β-glucan intravenously for six days separately.The peripherial leukocytes of all mice were counted before treated CTX，and 1，3，5，7 days after treated CTX.Results Three kinds of Candida albicans β-glucan can increase the numbers of leukocytes，neutrophilic granulocytes and monocytes in the peripheral blood.The spleen index in each group animal are increased，and megakaryocytes are increased in spleen and marrow.Conclusion Candida albicans β-glucan specially insoluble β-glucans is a kind of immunomodulator which can increase the numbers of leukocytes in the peripheral blood.
【Key words】 β-glucan；Candida albicans；leukocyte；immunomodulator
β-葡聚糖（β-glucan）是白色念珠菌細胞壁中含量最高的多糖。作為一類條件致病真菌多糖，白色念珠菌β-葡聚糖有著多種生物學活性和免疫藥理學作用，在抗炎、抗腫瘤、刺激造血等方麵都有很高的藥效學作用［1］，但有關不同性質的白色念珠菌β-葡聚糖升白細胞作用的研究甚少。本研究製備三種溶解性的β-葡聚糖，觀察其對環磷酰胺（cyclophosphamide，endoxan，cytoxan，CTX）所致的小鼠外周血白細胞減少的回升作用，為進一步確證白色念珠菌β-葡聚糖刺激造血係統使白細胞升高的作用機製，和進一步研究白色念珠菌β-葡聚糖有效成分或有效因子，為確立藥物質量控製標準和量－效關係提供理論依據。
1 材料與方法
1.1 動物與試劑 昆明種小白鼠，4～6周齡，體重20±2g，昆明醫學院動物科（雲南省實驗質量合格證0000481號）。沙氏液體培養基（Sabouraud’s dextrose agar）：蛋白腖10g、葡萄糖40g、溶於1000ml蒸餾水，高壓滅菌後備用；α澱粉酶：分子量～9600，酶活力：50μ/mg（上海伯奧生物科技有限公司）；白色念珠菌堿溶性β-葡聚糖（Candida albicans basic β-glucan， CABBG）、酸溶性β-葡聚糖（Candida albicans acidic β-glucan， CAABG)和不溶性β-葡聚糖（Candida albicans insoluble β-glucan， CAIBG）：均按文獻方法製備［2］。
1.2 儀器 LRH-250Z型震蕩培養箱（廣東醫療器械廠）；81-2型恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器廠）。
1.3 白念珠菌的培養和三種白色念珠菌β-葡聚糖的製備 取少量保存於密封無菌容器中的純白色念珠菌菌落，接種於沙氏液體培養基，接種後37℃恒溫搖床160次/min震蕩培養6～7天，3000rpm離心30min，收集菌體，冷凍保存。提取β葡聚糖的流程，見圖1。
1.4 小鼠白細胞減少模型的建立 除空白對照組外，各組小鼠腹腔注射CTX 100mg/(kg·d)，連續3天，建立小鼠外周血白細胞減少模型。
1.5 確定三組β-葡聚糖的給藥劑量 參照急性毒性實驗摸索LD50值，各組給藥劑量最後如表1。
1.6 統計學處理 急性毒性學實驗結果采用Bliss法計算LD50值。藥效學實驗采用SPSS11.5統計軟件進行數據處理分析，所有指標均以均數±標準差（x±s）表示，組間比較采用方差分析，以P＜0.05為差異有顯著性。
圖1 從白色念珠菌提取CABBG、CAABG、CAIBG的流程示意圖
Table 1 Dose design of experiment
2 結果
2.1 急性毒性學實驗 通過急性毒性實驗得到LD50值分別為：CABBG 36.8937mg/kg，CAABG 89.23549mg/kg，CAIBG 767.7753mg/kg；95%可信區間分別為CABBG組32.0052～42.5289mg/kg，CAABG組76.7182～103.8025mg/kg，CAIBG組663.748～888.106mg/kg。各實驗組小鼠肉眼觀察，除肝髒增大外未見明顯變化，病理HE切片顯示肝細胞有不同程度的腫脹和空泡變。
2.2 外周血白細胞變化 實驗第5、7、9天CABBG、CAABG、CAIBG組小鼠外周血白細胞數、中性粒細胞數、單核細胞數均顯著增高，其中第7天、第9天，CAIBG組白細胞數、單核細胞數較陽性對照組rhG-CSF升高，差異有顯著性。
2.3 脾髒、胸腺指數變化 實驗第5、7、9天，各組小鼠胸腺指數比較，差異無顯著性(P＞0.05)。各組小鼠給藥後，脾髒指數均增加。
2.4 藥效學實驗病理組織學改變 脾髒：白髓、紅髓分界不甚清楚，紅髓內細胞數增多，與空白對照組比較，CABBG、CAABG、CAIBG組脾竇出現較多的巨核細胞；骨髓：實驗組小鼠骨髓細胞增生活躍，與空白對照組比較，CABBG、CAABG、CAIBG組的巨核細胞數增多，提示巨核細胞係增生活躍。
3 討論
多能造血幹細胞具有多向分化的潛能，成年小鼠體內的多能造血幹細胞主要分布在脾髒和骨髓［3］。本研究顯示，實驗第7天時，各實驗組白細胞總數、中性粒細胞數都較rhG-CSF高(P＜0.05)；實驗第7天、第9天，CAIBG升高外周血白細胞、單核細胞數明顯高於CABBG、CAABG和rhG-CSF(P＜0.05)，說明β-葡聚糖，尤其是CAIBG可刺激血液係統白細胞、中性粒細胞、單核細胞數不同程度的升高。實驗第7天，CABBG、CAABG、CAIBG組小鼠脾髒指數均與rhG-CSF差異有顯著性(P＜0.05)；第9天，CAIBG脾髒指數較rhG-CSF、CABBG、CAABG組高，統計學表明差異均具有顯著性(P＜0.05)。與成年小鼠體內造血幹細胞的分布一致，實驗發現CABBG、CAABG、CAIBG組小鼠的組織病理學改變主要體現在骨髓和脾髒。與空白對照組比較，三組小鼠脾髒、骨髓巨核細胞數增多，CAIBG組要更明顯。因此，綜合外周血細胞數、脾髒指數、組織改變，我們推測β-葡聚糖在刺激小鼠外周血白細胞總數升高的過程中可能與刺激CFU-S增殖，向粒係、巨核係組細胞分化，進而生成粒細胞、單核細胞。
造血器官中基質細胞是造血微環境中重要的成分，與造血有關的基質細胞涉及到巨噬細胞、成纖維細胞、網狀細胞、淋巴細胞、內皮細胞和載脂肪細胞。其中，巨噬細胞被證明是在造血發生過程中有重要作用的一個微環境因素。巨噬細胞可通過細胞相互作用和分泌CSF、Epo、BPA、PGE和IL-1因子，調節所有四係血細胞的生長和分化［4］。以往研究證實念珠菌多糖可刺激巨噬細胞釋放細胞因子（CK）如IL-6、IL-8、IL-1、TNF等［5，6］。這些細胞因子可調控造血細胞的增殖活動：IL-1、TNF可刺激內皮細胞產生粒細胞集落刺激因子（G-CSF）及粒-巨噬係集落刺激因子（GM-CSF），G-CSF 和GM-CSF是使粒細胞和單核細胞的母細胞增殖分化的特異性誘導劑，並能刺激骨髓向外周血液釋放成熟的中性粒細胞，縮短中性粒細胞的成熟期［7］。同時，CSF可作用於粒-單係祖細胞（CFU-GM），誘導其增殖分化。IL-1還能激活幹細胞從G0期進入增殖周期，擴大幹細胞池；可為早期幹細胞對CSF起反應做準備，並誘導輔助細胞產生CSF及其他CK，從而間接調節造血。
β-葡聚糖是念珠菌重要的抗原決定簇［8］，單核細胞、巨噬細胞上都存在β-葡聚糖的特異性受體［9］。白色念珠菌的三種溶解性的β-葡聚糖，在結構上都是符合單核細胞、巨噬細胞上β-葡聚糖受體對於配體的要求，即能被特異識別β-（1→3）和β-（1→6）糖苷鍵［10］。巨噬細胞作為一類抗原遞呈細胞（APC）攝取β-葡聚糖抗原，隨後誘導性的表達高水平MHC，MHC與Th細胞上的TCR和CD4相互作用。使Th細胞功能增強，IL-2分泌增多，IL-2又能保持T細胞的存活與增殖Th細胞被激活後刺激B細胞分化、增殖［11］。實驗中，小鼠脾髒指數的明顯增加、脾髒、骨髓細胞增生，說明了β-葡聚糖在升高外周血白細胞的同時，也對激活機體的整個免疫係統活性產生影響。因此，CAABG、CABBG、CAIBG升高小鼠外周血白細胞總數、中性粒細胞和單核細胞的作用可能與各組β-葡聚糖能不同程度的被單核、巨噬細胞識別從而產生一係列細胞因子，刺激造血係統和促進中性粒細胞增殖有關。
免疫調節劑作為一種免疫治療的藥物已經廣泛應用於臨床。多糖作為一類免疫調節劑，不僅毒副作用小，資源豐富，而且具有明顯的調節機體免疫係統的作用。本研究說明白色念珠菌β-葡聚糖尤其是不溶性的β-葡聚糖能顯著增加小鼠脾重，並能對抗由CTX所致的小鼠脾髒萎縮及白細胞水平降低，是一種較好的免疫增強物質。
作者：崔 進，寧 莉 《昆明醫學院學報》
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