大腸埃希菌O157:H7檢測方法探討

【摘要】  目的  對大腸埃希菌O157:H7的檢測方法進行探討，減輕日常工作量，節約成本，提高陽性檢出率。方法  將PCR技術和免疫磁珠法相結合，樣品先進行PCR檢測，陽性的樣品再以免疫磁珠法進行分離和鑒定。結果  從245件豬糞、牛糞樣品中應用免疫磁珠和PCR結合方法，陽性檢出率為8.98%，高於直接應用免疫磁珠法的陽性檢出率6.12%。結論  此方法為大腸埃希菌O157:H7的檢測提供了一個新的思路，節約了人力和物力，提高了工作效率和陽性檢出率。

   

    【關鍵詞】  免疫磁珠法；大腸埃希菌O157:H7；PCR技術

   

    Study on method for detecting E.coli O157:H7

    

    【Abstract】  Objective  To discuss the detection  method for E.coli O157:H7.We can economize cost，release the work，enhance the positive rate.Methods  Combined the polymerase chain reaction technique with immunomagnetic sand method，we could detect these samples with PCR at first，and then collected and detected the positive species by using immunomagnetic sand method.Results  We have detected 245 species of dung by using this operational procedure.The result proved that the positive rate can be up to 8.98% above the rate of 6.12% by using immunomagnetic sand method only.Conclusion  It is a new idea for us to release the work and enhance the positive rate by using this operational procedure for detect the E.coli O157:H7.

   

    【Key words】  immunomagnetic sand method;  E.coli O157:H7; polymerase chain reaction 

    

    自從1982年在美國發生了首次由大腸埃希菌O157:H7引起出血性腸炎暴發以來，該菌在世界範圍內曾有過多次食源性暴發。1996年在日本發生的人類曆史上規模最大的一次暴發，引起了全世界的關注［1］。目前大腸埃希菌O157:H7 感染呈全球流行，已被認定是20世紀70年代以來新發現的8種傳染病病原體之一［2］。我國亦加強了大腸埃希菌O157:H7的監測。為了提高陽性檢出率，減輕工作量，本課題對大腸埃希菌O157:H7的檢測方法進行了探討和研究。

   

    1  材料與方法

   

    1.1  樣品來源  2004年5～10月采集奉賢區各個畜牧場豬糞、牛糞樣品，共計245件。

   

    1.2  儀器與試劑

   

    1.2.1  PCR擴增儀  Techne Flexigene。

   

    1.2.2  大腸埃希菌O157PCR引物  上遊引物：5’ AGGGCTATTGGTTCGTTCCT 3’，下遊引物：5’ AGGCCTGAAAGTCGTAGCAA 3’，其擴增產物片段長度為519bp。上述引物及相關試劑由上海寶生科技發展有限公司合成提供。

   

    1.2.3  全自動數碼凝膠成像係統  Tanon GIS-2010。

   

    1.2.4  免疫磁珠試劑、混勻器  (Dynabeads anti-E.coli O157;Dynal Sample Mixer)。

   

    1.2.5  培養基及診斷血清  MEC增菌液及各類糖發酵生化試劑均由上海市疾病預防控製中心提供。Chromagar O157顯色平板由上betway必威西汉姆联塞科技發展有限公司提供。大腸埃希菌O157及H7診斷血清由成都生物製品研究所提供，均在有效期內使用。

   

    1.3  方法

   

    1.3.1  PCR檢測法

   

    1.3.1.1  樣品的前處理  將樣品棉簽置於MEC增菌液9ml中，42℃增菌18h後，以5合1的混合方式，將增菌液混合。2500rpm離心10min。取上清液500μl，12000rpm離心5min，棄上清液，加100μl DNA提取液入沉澱中，振蕩混勻，置100℃水浴加熱10～15min，10000rpm離心1min，保留上清液待用。

   

    1.3.1.2  PCR擴增反應  取4μl上清液加入26μl PCR反應液中，同時做陽性對照。振蕩混勻，於2000rpm離心5s，將PCR反應管放入PCR擴增儀中。首先預變性94℃5min，然後按94℃ 30～40s、55℃ 30～40s、72℃ 30～40s循環35次，最後72℃延長3min。

   

    1.3.1.3  電泳及結果判斷  取15μl的擴增產物加入2%瓊脂糖凝膠孔中，接通電源，根據指示劑遷移的位置，判斷是否終止電泳。用凝膠成像係統對電泳結果進行分析。比較陽性對照，大腸埃希菌O157: H7特異性產物519bp為陽性。然後將PCR陽性的混合樣品再進行單個PCR檢測，確定單個陽性樣品。

   

    1.3.2  免疫磁珠富集法  吸取樣品增菌液1ml和20μl抗大腸埃希菌O157磁珠試劑於離心管中，置Dynal磁架上，放在混合器上輕輕攪動10min後，將磁板插入磁架，顛倒混勻3min，使濃縮磁珠吸附在管壁中間。打開離心管，小心吸取懸浮液，將磁板取下，加入1ml洗滌緩衝液(PBS-吐溫)，蓋上蓋，將磁架顛倒數次，置於混勻器重新懸浮磁珠。重複洗滌，懸浮過程3次後，用100μl洗滌液衝洗懸浮濃縮的磁珠細菌混合物，做成混懸液。將混懸液接種於Chromagar O157顯色平板，37℃培養24h。挑取可疑菌落於克氏雙糖培養基，37℃培養24h後，血清凝集，並做生化反應。

   

    1.3.3  PCR技術與免疫磁珠法結合檢測方法  將經PCR檢測為陽性的樣品再進行免疫富集分離鑒定。

   

    2  結果

   

    2.1  大腸埃希菌O157:H7檢出情況  不同大腸埃希菌O157:H7分離方法取得的陽性率有所不同。PCR方法陽性檢出率最高，達 10.2%。免疫磁珠法檢出15株，陽性檢出率為6.12%，兩者結合方法的陽性檢出率為8.98%。見表1。

表1  不同方法大腸埃希菌O157：H7檢測結果

    2.2  大腸埃希菌O157:H7菌株鑒定  檢出的22株可疑菌株均為革蘭陰性無芽孢短杆菌，生化反應符合大腸埃希菌特征，經大腸埃希菌O157、H7診斷血清進行玻片凝集反應，確定大腸埃希菌O157:H7菌株１５株，O157:H-菌株７株。送上海市疾病預防控製中心微生物實驗室進行毒素基因測定，結果均為陰性。

   

    3  討論

   

    應用免疫磁珠技術檢測大腸埃希菌O157:H7在本實驗室使用的是半自動混勻器，所以不僅操作費時費力，所需時間較長，且免疫磁珠試劑成本較高，不適合大批量的樣品同時檢測。而PCR技術能將死菌與含菌量極微的細菌都能檢測出，因此陽性率最高，但通過實驗發現有一部分樣品雖然PCR檢測為陽性，卻未能通過分離鑒定到菌株。所以PCR的結果隻是定性結論，為陽性菌的檢出提供一個指導方向［3］。因此本課題將PCR技術和免疫磁珠技術相結合，利用PCR的快速鑒定，將5個樣品混合為一個樣品進行檢測，將PCR檢測陽性的樣品，再以免疫磁珠法進行分離鑒定。這樣既減少了工作量，節約了人力，又降低了試劑成本。

   

    通過實驗發現，用PCR技術和免疫磁珠技術相結合的方法檢測大腸埃希菌O157:H7，陽性檢出率由用免疫磁珠法的6.12%提高到8.98%，說明此方法提高了大腸埃希菌O157:H7的陽性檢出率，這對於今後大腸埃希菌O157:H7的監測工作有很大幫助。

   

本次監測分離到的大腸埃希菌O157:H7雖然經分析是非產毒株，但都證實了大腸埃希菌O157:H7在奉賢地區的存在，具備了大腸埃希菌O157:H7感染的客觀因素，不容小視。而攜帶病原菌的家畜糞便可通過各種途徑汙染食品、飲水和蔬菜，是重要的傳染源［4］。因而，今後應加強對畜牧場的大腸埃希菌O157:H7的監測工作，加強消毒，嚴防糞便汙染，環境尤為重要。

 

作者：沈莉，謝曉紅，韓華忠 《中華醫學研究雜誌》

【參考文獻】

1  季曉輝.腸出血性大腸埃希氏埃希菌的鑒定與檢測.國外醫學·衛生學分冊，1997，24(3):174-177.

2  朱姝媛，徐慶，李剛山，等.大腸埃希菌O157: H7的分離鑒定及應用複合PCR法同時檢測其三個毒力因子.中國衛生檢驗雜誌，2004，14(4):445-446.

3  顧鳴，韓偉.複合PCR鑒定沙門菌的方法.中國衛生檢驗雜誌，2003，13(2):154-157.

4  冉陸.腸出血性大腸埃希菌(EHEC)流行趨勢.中國食品衛生雜誌，1999，3:31-35