產ESBLs、ESBLs+AmpC酶的肺炎克雷伯菌檢出及其耐藥性分析

近年來，隨著β-內酰胺類抗生素，尤其是頭孢三代類藥物的廣泛應用，引起產超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）、AmpCβ-內酰胺酶（AmpC酶）、ESBLs+AmpC酶等一係列耐藥菌株的產生，細菌耐藥現象日益嚴重。為更好地了解我院臨床分離菌株中產ES-BLs、ESBLs+AmpC酶肺炎克雷伯菌的檢出率及耐藥性，對138株肺炎克雷伯菌進行ESBLs、ESBLs+Am-pC酶測定及藥敏試驗，現將結果報道如下。

    1材料與方法

    1.1材料

    1.1.1試驗菌株 138株肺炎克雷伯菌均為我院2003年8月～2004年8月住院及門診病人感染標本中分離的菌株，根據臨床資料去除重複菌株。

    1.1.2質控菌株大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603，分別作為產ESBLs陰性和陽性對照菌。

    1.1.3 VITEK-AMS細菌鑒定係統及配套的GNI鑒定卡與GNS-120藥敏卡為生物梅裏埃公司生產。

    1.1.4 藥敏紙片 頭孢替坦（CTT）、頭孢吡肟（FEP）為英國Oxoid產品，亞胺培南（IPM）由默沙東公司提供，頭孢呱酮/舒巴坦（SCF）為舒普深公司提供，呱啦西林/他唑巴坦（TZP）等紙片購自北京天壇藥物生物技術開發公司。

    1.1.5藥敏用培養基 Mueller-Hinton瓊脂，英國Oxoid產品。

    1.2方法

    1.2.1菌株培養和鑒定細菌分離培養按照《全國臨床檢驗操作規程》進行。用VITEK-AMS專用卡GNI+鑒定。

    1.2.2ESBLs檢測

     （1）VITEK-AMS測定:采用GNS-120專用藥敏卡，嚴格按說明書操作，儀器自動檢查其ESBLs4個檢測孔，頭孢他啶（CAZ）與頭孢他啶/克拉維酸（CAZ/CA），頭孢噻肟（CTX）與頭孢噻肟/克拉維酸（CAZ/CA）孔的生長濁度≥50%時，判定為ESBLs陽性。

    （2）雙紙片協同試驗及確認試驗:將阿莫西林/克拉維酸（AMC）紙片置Mueller-Hinton平板中央，依次貼上頭孢曲鬆（CRO）、CAZ、CAZ/CA、ATM、CTX、CTX/CA，其中CRO、CAZ、氨曲南（ATM）、CTX與AMC距離為18mm，CAZ/CA、CTX/CA與AMC距離為25mm，且CAZ/CA、CTX/CA與其它紙片間距離>24mm。

    （3）雙紙片協同試驗結果判斷:如在AMC紙片與其周圍CRO、CAZ、ATM、CTX任一種紙片處出現協同抑菌視為產超廣譜β-內酰胺初篩陽性。

    （4）確認試驗:按NCCLs紙片標準，CAZ、CAZ/CA和CTX、CTX/CA2組抗生素紙片任一組中含CA的紙片和不含CA的紙片菌抑菌圈直徑相差≥5mm，即為產ESBLs菌株。

    1.2.3產ESBLs+AmpC酶株的檢測

    （1）表型篩選試驗參閱文獻 ［1，2］選用IPM、FEP、CAZ/CA、CAZ、CTX/CA、CTX、CTT7種抗生素進行篩選試驗。若IPM敏感，而CTT、FEP、CAZ、CAZ/CA、CTX、CTX/CA耐藥為產ESBLs+AmpC酶株。

    （2）擴散協同試驗參閱文獻 ［3，4］經表型篩選試驗為產ESBLs+AmpC酶株作擴散協同試驗，每株菌取兩平板，一平板將AMC紙片置Mueller-Hinton平板中央，四周依次貼上CAZ、CTX、ATM、CRO;另一平板將AMC紙片置Mueller-Hinton平板中央，在與AMC紙片距離為15mm、20mm、25mm、30mm處各貼FEP。若AMC與CAZ、CTX、ATM、CRO不協同，但與

FEP協同為產ESBLs+AmpC酶株。

    1.2.4藥敏試驗采用紙片擴散（K-B法），判斷標準按NCCLs2002版標準執行。

    1.2.5統計分處理采用WHONET5軟件。

    2結果

    2.1產ESBLs陽性率及病房分布臨床分離株138株，經VITEK GNS-120卡鑒定56株產ESBLs，紙片協同法55株產ESBLs，紙片確認法57株產ESBLs占41.3%（57/138）。各科室產ESBLs株從高到低依次為:神經外科30株，其中28株為NCU病房，2株為普通病房的同一床位，且時間較近。ICU病房8株，嬰兒科5株，其餘8株來自外科病房，6株來自內科病房。

2.2 產ESBLs+AmpC酶陽性率

　　57株產ESBLs的肺炎克雷伯菌中，2株表型CTT、FEP、CAZ、CAZ/CA、CTX、CTX/CA均耐藥，IPM敏感，確定為ESBLs+AmpC酶株，占1.4%（2/138），另外55株產ESBLs肺炎克雷伯菌，有23株CTT紙片抑菌環內存在散在菌落，挑取其散的菌落，經VITEK鑒定為肺炎克雷伯菌，對其進行表型篩選試驗，CTT、FEP、CAZ、CAZ/CA、CTX、CTX/CA耐藥，IPM敏感。說明其散在菌落為同時產ESBLs+AmpC酶株，占16.7%（23/138），25株占18.1%（25/138）。對25株表型為產ESBLs+AmpC酶株進行擴散協同試驗:FEP與AMC距離為15mm時，23株發生協同反應;距離為20mm時，17株發生協同反應;距離為25mm時，10株發生協同反應;距離為30mm時，2株發生協同反應。

    2.3耐藥率

    2.3.1非ESBLs、ESBLs+AmpC酶株、產ESBLs、產ESBLs+AmpC酶的肺炎克雷伯菌的耐藥性，見表1。 表1非產ESBLs、ESBLs+Ampc酶株，產ESBLs株，產ESBLs+Ampc酶株對16種抗菌藥物的藥敏結果（略）注:與Ⅰ組比較， * P<0.05;與Ⅱ組比較， △ P<0.05

    2.3.223株CTT紙片抑菌環內散在菌落（產ES-BLs+AmpC酶株）與原分離株（產ESBLs）藥敏對照:對IPM均敏感，產ESBLs株對環丙沙星（CIP），慶大黴素（GM）、阿米卡星（AK）、複方磺胺甲口惡唑（SXT）敏感的，對應的產ESBLs、ESBLs+Ampc酶株表現為耐藥。

    3討論

    超廣譜β-內酰胺酶（ESBLs）是一類新的β-內酰胺酶（BLA），屬Bush分類中的2be類酶，主要產生於大腸埃希菌和克雷伯菌屬，能水解三代頭孢如頭孢他啶、頭孢曲鬆、頭孢噻肟和單環酰胺類氨曲南，並被BLA抑製劑如克拉維酸抑製 ［5，6］。AmpC酶是染色體或質粒介導的頭孢菌素酶，能水解三代頭孢及 單環酰胺類，不能被BLA抑製劑和頭黴素類抑製，能被四代頭孢、碳青黴烯類抑製。產ESBLs+AmpC酶株對三代頭孢、單環酰胺類、頭黴素類及含酶抑製劑、四代頭孢均高度耐藥，可用碳青黴烯類及在藥敏試驗敏感的氨基糖苷類或氟喹諾酮類。本研究發現57株產ESBLs菌中有23株CTT抑菌環內存在散在菌落，而用VITEK-120藥敏卡儀器鑒定為CTT敏感。對這類菌株如果用頭黴素類或酶抑製劑，則可能篩選出高產的ESBLs+AmpC酶株而導致臨床治療無效，建議臨床微生物室對經VITEK GNS-120藥敏卡鑒定為產ESBLs株補貼頭黴素類藥敏，可及時發現抑菌環內的耐藥株（產EBSLs+AmpC酶株），並及時將信息報告給臨床醫生，以有效控製ESBLs+Am-pC酶株的傳播流行。

對於產EBSLs+AmpC酶株檢測，表現篩選實驗符合率為89.58% ［1］ 擴散協同法FEP與AMC距離國內未見報道，本研究參照檢測ESBLs擴散協同法 ［7］ ，FEP與AMC距離設定為1mm、20mm、25mm、30mm，產生協同反應分別為23株、17株、10株與2株，故推薦距離15mm時為最佳距離。

作者：卜黎紅　徐瑞龍　單小雲　許健波　朱以軍《全科醫學臨床與教育》

　　參考文獻

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