1株攜帶多種抗生素滅活酶基因的銅綠假單胞菌臨床分離株

【摘要】  目的 了解銅綠假單胞菌攜帶多種抗生素滅活酶基因的情況和有關機製。方法應用聚合酶鏈式反應(PCR)法對多重耐藥的銅綠假單胞菌進行β內酰胺酶基因、氨基糖苷類修飾酶基因和oprD2基因檢測與分析。結果 PCR結果顯示CARB和TEM型β內酰胺酶基因，aac(6′)I、aac(6′)II、ant(2″)I、ant(3″)I氨基糖苷類修飾酶基因擴增陽性。oprD2基因擴增檢測呈缺失型。CARB和TEM型β內酰胺酶基因擴增產物經測序、BLASTn比對分析為blaCARB3和blaTEM1。結論 銅綠假單胞菌可攜帶多種抗生素滅活酶基因，多重耐藥銅綠假單胞菌(MDRP)的逐漸增多，嚴重威脅臨床的抗感染治療。

【關鍵詞】  銅綠假單胞菌；抗生素滅活酶； 多重耐藥

　　銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)為條件致病菌。近年來銅綠假單胞菌多重耐藥株引起的感染常使臨床治療麵臨諸多困難。近年研究發現，銅綠假單胞菌可以通過獲得抗生素滅活酶而耐藥。如：獲得各種β內酰胺酶編碼基因和/或外膜孔蛋白oprD2基因缺失導致對β內酰胺類抗生素耐藥［1～5］，獲得氨基糖苷類修飾酶鈍化氨基糖苷類抗生素而耐藥［6］。我們從一例肺癌合並嚴重肺部感染患者的氣管分泌物中分離出一株多重耐藥銅綠假單胞菌，對其進行β內酰胺酶基因、氨基糖苷類修飾酶基因和oprD2基因檢測與分析，現報道如下。

　　1  材料與方法

　　1.1  標本來源

   

　　患者沈某，女性，81歲。2005年7月因肺癌合並嚴重肺部感染入院，從患者氣管分泌物中分離到銅綠假單胞菌WX2232。

　　1.2  菌株鑒定

   

　　細菌鑒定采用法國VITEK32全自動微生物鑒定係統。

　　1.3  藥敏試驗

   

　　抗生素敏感試驗采用微量肉湯稀釋法， 按CLSI/NCCLS(1999年)標準操作及判斷結果，抗生素包括氨苄西林、頭孢吡肟、頭孢曲鬆、頭孢他啶、頭孢唑林、亞胺培南、氨曲南、慶大黴素、妥布黴素、環丙沙星、左氧氟沙星、複方磺胺甲口惡唑、呋南妥因、氨苄西林/舒巴坦、呱拉西林/三唑巴坦。

　　1.4  耐藥基因檢測

   

　　(1)模板製備  挑純培養菌落置入0.5ml離心管內(管內預置200ng/ml蛋白酶K溶液)。56℃水浴2h，改95℃水浴10min。15000r/min離心30s，上清液移入另一新的0.5ml離心管作為模板液置-20℃冰箱備用。

   

　　(2)耐藥基因的檢測  β內酰胺酶基因、氨基糖苷類修飾酶基因和oprD2基因檢測均為聚合酶鏈反應(PCR)法。PCR擴增引物序列見表1。各種靶基因PCR擴增體係均為：每反應體係P1、P2引物各0.5μmol/L，KCl 10mmol/L，(NH4)2SO4 8mmol/L，MgCl2 2mmol/L，TrisHCl(pH9.0)10mmol/L，NP40 0.5%，BSA 0.02%(W/V)，Taq DNA聚合酶1U。總反應體積20μl(其中模板液5μl)。產物>500bp熱循環參數均為：93℃預變性2min，然後93℃60s→55℃ 60s→72℃ 60s， 循環35個周期，最後一次72℃延長至5min。產物<500bp熱循環參數均為：93℃預變性2min，然後93℃30s→55℃30s→72℃60s，循環35周期，最後一次72℃延長至5min。產物經2%瓊脂糖凝膠電泳，出現與陽性對照分子相當的目的條帶判為陽性，並攝像保存。測序為雙脫氧末端終止法在3730儀(美國ABI公司)上進行。測得序列與美國GenBank核酸庫已登錄的序列作比對(www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)。耐藥基因檢測試劑盒、靶基因PCR引物序列和陽性對照DNA由無錫市克隆遺傳技術研究所提供。

2  結果

   

　　銅綠假單胞菌WX2232株除對呱拉西林/三唑巴坦敏感(64μg/ml)外，對β內酰胺類(氨苄西林、頭孢吡肟、頭孢曲鬆、頭孢他啶、頭孢唑林、亞胺培南、氨曲南、氨苄西林/舒巴坦)、氨基糖苷類(慶大黴素、妥布黴素)、環丙沙星、左氧氟沙星、複方磺胺甲口惡唑、呋南妥因等均耐藥。PCR結果顯示CARB、TEM型β內酰胺酶基因，aac(6′)I、aac(6′)II、ant(2″)I、ant(3″)I氨基糖苷類修飾酶基因擴增陽性。oprD2基因擴增檢測呈缺失型。CARB、TEM型β內酰胺酶基因擴增產物經測序、BLASTn比對分析為blaCARB3和blaTEM1。圖1、2為aac(6′)I基因PCR電泳圖。

　　3  討論

   

　　銅綠假單胞菌WX2232株對β內酰胺類(氨苄西林、頭孢吡肟、頭孢曲鬆、頭孢他啶、頭孢唑林、亞胺培南、氨曲南、氨苄西林/舒巴坦)、氨基糖苷類(慶大黴素、妥布黴素)抗生素均耐藥。PCR檢測顯示blaCARB(blaCARB3型)、blaTEM(blaTEM1型)、aac(6′)I、aac(6′)II、ant(2″)I、ant(3″)I基因陽性和oprD2基因呈缺失型，表型與基因型相符。oprD2基因所編碼的銅綠假

       

　　表1        PCR引物序列　略

　　圖1    略

　　圖2    略

oprD2基因缺失是銅綠假單胞菌WX2232株亞胺培南、β內酰胺類/β內酰胺酶抑製劑複合製劑耐藥的原因。隨著廣譜頭孢菌素類、碳青黴素烯類抗生素在臨床上大量使用，銅綠假單胞菌對臨床常用抗生素靈敏度不斷的下降，尤其是多重耐藥銅綠假單胞菌(MDRP)的逐漸增多嚴重威脅臨床的抗感染治療［8］，如何合理應用抗生素，以及采取有效措施控製耐藥株出現，是需要著力解決的問題。

 

作者：王繼東  糜祖煌  周麗珍《中國抗生素雜誌》

【參考文獻】

  　　［1］ 諸葛青雲，黃支密，糜祖煌. 耐亞胺培南銅綠假單胞菌和嗜麥芽寡養假單胞菌抗菌藥物耐藥基因研究［J］. 中國抗生素雜誌，2005，30(11)：677

　　［2］ 植誌全，何誌恒，江鵬，等. 多重耐藥綠膿假單胞菌β內酰胺類氨基糖苷類耐藥相關基因研究［J］. 中華檢驗醫學雜誌，2005，28(11)：1211

　　［3］ 李智山，鄧三季，楊燕，等. 綠膿假單胞菌β內酰胺類耐藥相關基因研究［J］. 中華檢驗醫學雜誌，2005，28(10)：1030

　　［4］ Patzer J, Toleman M A, Deshpande L M, et al. Pseudomonas aeruginosa strains harbouring an unusual blaVIM4 gene cassette isolated from hospitalized children in Poland (1998～2001) ［J］. J Antimicrob Chemother,2004,53(3):451

　　［5］ Senda K, Arakawa Y, Nakashima K, et al. Multifocal outbreaks of metallobetalactamaseproducing Pseudomonas aeruginosa resistant to broadspectrum betalactams, including carbapenems ［J］. Antimicrob Agents Chemother,1996,40(2):349

　　［6］ 糜祖煌. 銅綠假單胞菌耐藥基因及其檢測［J］. 現代實用醫學，2004，16(9)：558

　　［7］ 李德淳，湯乃軍，李雲主譯(Richard PW主編). 醫院內感染的預防與控製(第4版)［M］. 天津：天津科技翻譯出版公司，2005：279

     ［8］ van Eldere J. Multicentre surveillance of Pseudomonas aeruginosa susceptibility patterns in nosocomial infections ［J］. J Antimicrob Chemother,2003,51:347