沈陽地區兒科產超廣譜β內酰胺酶革蘭陰性菌的耐藥性與基因型研究

【摘要】  目的 研究沈陽地區兒科產超廣譜β內酰胺酶(extendedspectrum βlactamases，ESBLs)革蘭陰性菌的耐藥性及ESBLs基因型分布，初步探討其多重耐藥性傳播的分子機製。方法 KB法藥敏試驗，按照CLSI/NCCLS 2005年標準篩選確認ESBLs表型，PCR法進行ESBLs基因型別分析，擴增I類整合子全可變區，分析產ESBLs菌株中整合子的存在情況。結果 在分離出的180株革蘭陰性菌中，有62株經表型確證試驗證實為產ESBLs菌株，檢出率34.4%。產ESBLs菌株對各種抗菌藥物的耐藥率明顯高於非產ESBLs菌株。基因分型結果表明，blaTEM基因陽性48株(77.4%)，blaSHV陽性32株(51.6%)，blaCTXM9組陽性31株(50%)，blaCTXM3組陽性12株(19.4%)。62株ESBLs菌株中26株整合子全可變區PCR擴增陽性，陽性率41.9%。結論 沈陽地區兒科革蘭陰性菌中ESBLs菌株檢出率較高，多數菌株同時攜帶兩種或兩種以上不同型別的β內酰胺酶，且為多重耐藥菌株，整合子機製參與其多重耐藥性的形成與傳播。

【關鍵詞】  革蘭陰性菌；超廣譜β內酰胺酶； 耐藥； 基因型； 整合子； 沈陽地區； 兒科

　　Investigation of antimicrobial resistance and genotypes of extendedspectrum　βlactamases producing Gramnegative bacteria isolated　from pediatrics in Shenyang

　　ABSTRACT  Objective  To study the antimicrobial resistance and genotypes of extendedspectrum βlactamases (ESBLs)producing Gramnegative bacteria isolated from pediatrics in Shenyang and preliminarily investigate the molecular mechanisms of their multiple antibiotic resistance dissemination process.  Methods Antibiotics susceptibility was tested by KirbyBauer method. ESBLsproducing isolates were detected by phenotypic confirmatory test according to CLSI/NCCLS M100S15 (2005). The genotypes of ESBLs were analyzed by PCR, and the complete variable region of class 1 integron were amplified in order to analyze the presence and characterization of class 1 integron in ESBLs.  Results  Among a total of 180 Gramnegative isolates, 62 isolates were identified as ESBLs by phenotypic confirmatory test and the incidence was 34.4%. The ESBLsproducing isolates were more resistant to most antimicrobials than non ESBLsproducers. The results of βlactamases genotyping showed that 48 isolates carried blaTEM (77.4%)，32 isolates carried blaSHV (51.6%), 31 isolates carried blaCTXM9 (50%)and 12 isolates carried blaCTXM3 (19.4%). Class 1 integrons were identified among 26 isolates and the positive rate was 41.9%.  Conclusions  In Shenyang pediatrics, the incidence of ESBLsproducing strains was high and most isolates were multiple resistant and produced more than one type of βlactamase. The mechanisms of integron took part in the emergence and dissemination of their multiple resistance.

   

　　KEY WORDS  Gramnegative bacteria;  Extendedspectrum βlactamases;  Resistance;  Genotype;  Integron;  Shenyang area;  Pediatrics 

　　產超廣譜β內酰胺酶(ESBLs)是革蘭陰性菌對第三代頭孢菌素及單環內酰胺類抗菌藥物耐藥的重要原因［1，2］。兒科患者由於年齡和疾病等因素，是產超廣譜β內酰胺酶細菌的易感人群。為了解沈陽地區兒科產超廣譜β內酰胺酶革蘭陰性菌的耐藥情況和基因型特征，為沈陽地區兒科抗生素使用及臨床預防產ESBLs細菌引起的感染提供參考依據，本文對2005年1月～2005年12月沈陽市兒科患者中分離的180株革蘭陰性杆菌進行ESBLs表型篩選和確認，分別用TEM、SHV、CTXM、OXA、PER和VEB型β內酰胺酶基因的特定引物進行PCR擴增，分析ESBLs基因型別，擴增I類整合子全可變區，探討其多重耐藥性的傳播機製。

　　1  材料與方法

　　1.1  菌株來源

   

　　2005年1月～2005年12月沈陽市兒科患者中臨床分離的革蘭陰性杆菌180株，其中包括大腸埃希菌59株，克雷伯菌屬27株，銅綠假單胞菌29株，不動杆菌屬22株，陰溝腸杆菌11株，聚團腸杆菌5株，產氣腸杆菌2株，弗氏檸檬酸杆菌5株，黏質沙雷菌7株，液化沙雷菌3株，嗜麥芽寡養單胞菌6株，熒光假單胞菌2株，奇異變形菌1株，摩根摩氏菌1株。所有菌株均采用法國BioMerieux公司全自動微生物鑒定係統的革蘭陰性菌鑒定卡確認。

　　1.2  抗生素紙片

   

　　氨苄西林(ABPC)、呱拉西林(PIPC)、阿米卡星(AMK)、頭孢呋辛(CXM)、頭孢唑林(CEZ)、頭孢他啶(CAZ)、頭孢噻肟(CTX)、頭孢曲鬆(CRO)、頭孢克洛(CCL)、頭孢吡肟(CPE)、頭孢西丁(CFX)、呱拉西林/三唑巴坦(PIPC/TB)、環丙沙星(CPLX)、左氧氟沙星(LFLX)、複方磺胺甲口惡唑(SMZ/TMP)、慶大黴素(GM)、氨曲南(AZ)、亞胺培南(IMP)，頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CA)、頭孢噻肟/克拉維酸(CTX/CA)和阿莫西林/克拉維酸(AMPC/CA)，以上紙片均為英國Oxoid公司產品。

　　1.3  主要試劑與儀器

   

　　MH(MuellerHinton)瓊脂、肉湯培養基為英國Oxoid公司產品；DNA分子量標準(DL2000)、dNTP、Taq DNA聚合酶均購自TaKaRa公司；PCR擴增儀(美國PE公司GeneAmp PCR System 2700型)；DYWI恒壓恒流電泳儀(北京六一廠)；凝膠成像係統(美國Kodak公司)。

　　1.4  藥敏試驗及產ESBLs菌株的篩選與確認

   

　　采用KB紙片擴散法，進行所有菌株的藥敏試驗。同時按照美國國家臨床實驗室標準化研究所(CLSI/NCCLS)2005年版推薦的標準進行ESBLs初步篩選和表型確證試驗［3］。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922(陰性對照株)，大腸埃希菌ATCC35218(產廣譜β內酰胺酶株)，肺炎克雷伯菌ATCC700603(產超廣譜β內酰胺酶株)。

　　1.5  ESBLs基因的PCR擴增

   

　　采用煮沸法提取細菌DNA，取處於對數生長期的新鮮菌液1ml，離心收集菌體，加入600μl雙蒸水，煮沸15min，快速冷卻，15000r/min離心10min，上清液即可作為DNA模板進行PCR擴增。根據GenBank和EMBL公布的各型ESBLs耐藥基因序列設計引物，由大連寶生物公司合成。引物序列見表1。

　　1.6  產ESBLs菌株耐藥性傳播機製

   

　　根據I類整合子的5′保守區和3′保守區設計引物，擴增其全可變區，分析ESBLs菌株中I類整合子的存在情況。引物序列見表1，循環參數為94℃預變性5min，94℃ 45s，58℃ 45s，72℃ 3min，30個循環，最後72℃延伸10min。PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，紫外燈下觀察結果。

　　2  結果

　　2.1  ESBLs菌株檢測結果

   

　　在分離出的180株革蘭陰性菌中，62株經表型確證試驗證實為產ESBLs菌株，檢出率為34.4%，其中大腸埃希菌30株，克雷伯菌屬15株，陰溝腸杆菌6株，沙雷菌8株，聚團腸杆菌2株，弗氏檸檬酸杆菌1株。

　　2.2  ESBLs菌株與非ESBLs菌株耐藥性比較

   

　　產ESBLs菌株多表現為多重耐藥，對各種抗菌藥物的耐藥率明顯高於非產ESBLs菌株。其中ESBLs菌株對氨苄西林、呱拉西林、頭孢呋辛、頭孢唑林、頭孢克洛、頭孢噻肟和頭孢曲鬆等7種抗生素的耐藥率達到了100%；亞胺培南、阿米卡星、頭孢吡肟、頭孢他啶、呱拉西林/三唑巴坦對ESBLs菌株仍保持較高抗菌活性，比較結果見表2。

2.3  β內酰胺酶基因型

   

　　本研究采用8對β內酰胺酶基因引物進行擴增，其中blaCTXM2組、blaPER、blaVEB及blaOXA23基因未擴增出陽性結果，blaTEM、blaSHV、blaCTXM3組和blaCTXM9組擴增產物片段大小與預期相符(圖1)。62株產ESBLs菌株中blaTEM基因陽性48株(77.4%)，blaSHV陽性32株(51.6%)，blaCTXM9組陽性31株(50%)，blaCTXM3組陽性12株(19.4%)。各型β內酰胺酶基因單獨或聯合檢出情況見表3。       

　　表1  β內酰胺酶基因及I類整合子PCR擴增所用引物　略

　　表2        產ESBLs和非產ESBLs革蘭陰性菌的耐藥率(略)

　　表3        ESBLs菌株β內酰胺酶基因型分布　略

　　2.4  ESBLs菌株整合子檢測

   

　　62株ESBLs菌株中26株整合子全可變區PCR擴增陽性，陽性率41.9%，其中大腸埃希菌10株，克雷伯菌屬9株，陰溝腸杆菌3株，聚團腸杆菌2株，沙雷菌2株。陽性菌株擴增片段多介於1000～2000bp之間(常見1.8kb左右的擴增產物)，另有1株擴增產物大於2000bp，1株擴增出兩條不同大小片段的陽性帶。部分菌株整合子擴增情況見圖2。

　　3  討論

   

　　近年來由於超廣譜β內酰胺類抗生素在臨床上大量使用，導致產ESBLs的革蘭陰性菌不斷增加［1］。我國已有部分地區報道大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌中ESBLs檢出率超過50%［9，10］。第三代頭孢菌素因抗菌譜廣、毒性較低等特點，常常在兒科住院患者中大量甚至長期使用，因此兒童ESBLs發生率並不亞於成人。張泓等報道兒童呼吸道感染病原菌ESBLs檢出率在大腸埃希菌為32.6%，肺炎克雷伯菌為28.6%［11］。本研究對沈陽地區180株從兒科患者分離的革蘭陰性菌進行ESBLs的篩選及確證，檢出率為34.4%；本組62株ESBLs全部為多重耐藥株，對青黴素、第一、二代頭孢菌素及部分第三代頭孢菌素的耐藥率達到100%，應引起臨床醫生高度重視。   

　　ESBLs的編碼基因分布具有明顯的地域特點［2］，如blaTEM和blaSHV型是北美地區流行的主要基因型［12］，韓國以blaSHV12更常見［13］。近年來，非TEM、非SHV型ESBLs種類和數量都不斷增加，包括CTXM、PER、VEB和OXA等類型。其中CTXM型酶對頭孢噻肟具有強大的水解活性，對頭孢曲鬆的水解能力也很高，但對頭孢他啶和氨曲南的水解能力較差。自20世紀90年代初在歐洲發現以來［14］，已遍及東南亞、歐洲等地區［15～17］。我國北京、上海、浙江、廣州等地報道的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌ESBLs基因型也均以CTXM型為主，其次為SHV型［18，19］。本研究發現，沈陽地區兒科CTXM型ESBL累計檢出率達69.4%，與其耐藥表型相符；本組62株ESBLs頭孢噻肟和頭孢曲鬆耐藥率達100%，而頭孢他啶耐藥率僅為40.3%。本組blaTEM和blaSHV基因檢出率也較高，分別為77.4%和51.6%，但是否為TEM和SHV型ESBL還有待進一步研究證實。

   

　　整合子介導的多重耐藥及水平傳播機製近年已越來越引起人們的重視。整合子是具有捕獲外源基因並使之轉變為功能性基因的表達單位，它可將β內酰胺類、氨基糖苷類、喹諾酮類等多種耐藥基因以基因盒的方式組裝在一起，並可在菌種內及種間傳播，容易引起院內感染的暴發流行［20，21］。本研究結果顯示，ESBLs菌株整合子的發生率較高，62株中41.9%攜帶I類整合子，整合子片段大小介於1.0～3.0kb之間，並有攜帶多個I類整合子的傾向，它們含有不同的耐藥基因，參與形成ESBLs細菌多重耐藥表型，並引起菌種內及菌種間多重耐藥性的水平傳播。

   

沈陽地區兒童也麵臨著產ESBLs多重耐藥的革蘭陰性菌感染的威脅，這與臨床上長期以來大量使用頭孢噻肟等第三代頭孢菌素有關。臨床抗菌藥物大量和不合理應用促進了產酶株的出現，也是整合子發生進化和捕獲更多耐藥基因的重要原因。因此兒科臨床亦應嚴格限製和合理使用抗生素，進行細菌耐藥性的監測，采取積極有效的消毒隔離和治療措施，以減少產酶菌株的出現，控製ESBLs及其耐藥基因的水平傳播。

作者：倪朝輝 李凡《中國抗生素雜誌》

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