產誌賀毒素大腸埃希菌產超廣譜β內酰胺酶基因型的研究

【摘要】  目的 探討產誌賀毒素大腸埃希菌產超廣譜β內酰胺酶(extended spectrum βlactamases，ESBLs)類型及耐藥機製。方法 采用紙片瓊脂擴散法篩選36株產誌賀毒素大腸埃希菌產ESBLs菌株，接合傳遞實驗、質粒譜分析、PCR檢測耐藥基因和DNA序列分析產ESBLs菌株的表型和基因型。結果 雙紙片擴散法證明有2株產誌賀毒素大腸埃希菌產ESBLs，美國株E.coli 5 nonO157:H7和中國株E.coli 27 O157:H7對頭孢他啶等第三、第四代頭孢菌素和氨基糖苷類抗生素耐藥，並能通過5.8kb的質粒傳遞給受體菌。PCR檢測含有blaTEM基因。DNA同源分析表明861bp的blaTEM DNA片段與blaTEMI DNA片段同源。結論 產誌賀毒素大腸埃希菌美國株和中國株產生相同類型的ESBLs，表現出對第三、第四代β內酰胺酶類抗生素耐藥。

【關鍵詞】  產誌賀毒素大腸埃希菌超廣譜β內酰胺酶 基因型

    Study on the genotype of extended spectrum betalactamases among

    ABSTRACT  Objective  To investigate the genotype and antimicrobial mechanism of extended spectrum betalactamases among Shiga toxinproducing E.coli (STEC).  Methods  Antibiotic susceptibility was tested by the disk diffusion to screen out the strains that produced the ESBLs; conjugative transfer test, plasmid profile, PCR and DNA sequencing were used to detect the phenotype or genotype of STEC.  Results  Of 36 samples, there two isolates producing ESBL, E.coli 5 non O157:H7 from American and E.coli 27 O157:H7 from China, and they both were resistant to aminoglycosides and the third generation cephalosporins such as ceftazidime. Double disk test showed that they produced ESBL and the resistant phenotype were transferred to the recipient by a conjugative plasmid of 5.8kb. TEM βlactamasesencoding gene was identified by PCR and the 861bp fragment of blaTEM DNA had a high homology with that of blaTEM1.  Conclusions  STEC isolates from America and China carry the same genotype ESBLs, which may be the major resistance mechanism against the third and fourth generation cephalosporins.

    KEY WORDS  Shiga toxinproducing E.coli (STEC);  Extended spectrum βlactamases (ESBL);  Genotype

      產誌賀毒素大腸埃希菌(Shiga toxinproducing E.coli，STEC)有110種血清型，主要血清型O157：H7可引起出血性結腸炎(hemorrhagic colitis，HC)和溶血性尿毒綜合症(hemolytic uremic syndrome，HUS)。牛羊等動物是其天然宿主，抗菌藥物作為動物生長促生長劑，造成動物腸道細菌多重耐藥， 同時STEC感染的臨床患者在應用廣譜抗生素進行治療時，可導致STEC多藥耐藥菌株的增加［1］。

    ESBLs主要由革蘭陰性菌產生，通過質粒介導，對包括第一、第二和第三代頭孢菌素以及氨曲南在內的β內酰胺酶類廣譜抗生素具有水解作用［2］。ESBLs的種類超過200餘種，最常見的是TEM和SHV型衍生的β內酰胺酶，還包括PER型酶、CTX型酶及VEB1等型酶［3］。ESBLs編碼基因具有可轉移性，隨質粒在同種或不同種細菌間傳播，導致耐藥基因快速傳播。國內、外不同地區腸杆菌科分離株所產生ESBLs的類型不一，以TEM型和SHV型多見，而STEC產ESBLs菌株流行情況國內、外均未見報道。本文應用細菌學與分子生物學方法研究STEC菌株ESBLs的表型及基因型，探討STEC產ESBLs的基因類型及耐藥機製。

    1  材料與方法                      

    1.1  菌株來源

    STEC共36株，其中20株為美國分離株，16株為中國分離株。質控菌株大腸埃希菌ATCC25922、金葡菌ATCC25923、銅綠假單胞菌ATCC27853由吉林大學基礎醫學院病原生物學教研室提供。

    1.2  試劑

    實驗用MH培養基和藥敏紙片購自Oxoid公司；藥敏紙片(μg/片)包括：氨苄西林(AMPC)10，頭孢曲鬆(CRO)30，頭孢他啶(CAZ)30，頭孢他啶/克拉維酸(CAZ/CA)30/10，頭孢噻肟(CTX)30，頭孢噻肟/克拉維酸(CTX/CA)30/10，氨曲南(AZ)30，氨苄西林/舒巴坦(AMPC/SB)10/10，阿莫西林/克拉維酸(AMPC/CA)10/10，亞胺培南(IMP)10，氯黴素(CHL)30，慶大黴素(GM)10，四環素(TC)30，環丙沙星(CPLX)5，複方磺胺甲口惡唑(SMZ/TMP)1.2/23.7，紅黴素(EM)15，鏈黴素(SM)10和阿米卡星(AMK)50；Taq DNA聚合酶、dNTP混合液、DNA分子標準參照物購自TaKaRa。PCR產物純化、凝膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒購自QIAGen公司。

    1.3  儀器

    GeneAmpR PCR System2700 Applied Biosystem(USA)，DYYⅢ型水平電泳儀(北京市六一儀器廠)，UV WHITE2020D凝膠成像分析係統(USA，cold spring)。

    1.4  藥敏實驗

    采用瓊脂紙片擴散法測定36株STEC對18種抗菌藥物的敏感性，藥敏判定標準遵照美國臨床實驗室標準化研究所(CLSI/NCCLS 2002)規定執行。大腸埃希菌ATCC25922、銅綠假單胞菌ATCC27853作為藥敏質控菌株［4］。

    1.5  ESBLs表型確定試驗

    采用雙紙片協同試驗，將初選可疑ESBLs菌株用頭孢噻肟、頭孢噻肟+克拉維酸、頭孢他啶及頭孢他啶+克拉維酸分別測定紙片的中心距離，抑菌環直徑增大≥5mm為產ESBLs陽性［4］。

    1.6  質粒提取及質粒圖譜分析

    用QIA快速質粒提取試劑盒按說明書方法提取質粒，0.6%瓊脂糖凝膠電泳12h，凝膠成像係統照相分析。

    1.7  接合傳遞試驗

    供體菌為產ESBLs的STEC，受體菌為E.coli C600，采用含有利福平(150μg/ml)和頭孢他啶(500μg/ml)的MH培養基進行轉接合子的篩選。進行轉接合子耐藥表型的鑒定，堿裂解法直接提取細菌轉接合子DNA。

    1.8  PCR擴增

    (1)引物設計  根據GenBank公布的blaTEM和blaSHV DNA序列分別設計合成2對特異性引物，分別擴增861和392bp片段，由上海生物工程公司合成。

    blaTEM引物：

    P1: FATGAGTATTCAACATTTCCGTG;

    P2:RTTACCAATGCTTAATCAGTGAG

    blaSHV引物：

    P1: FAGGATTGACTGCCTTTTTG;

    P2:RATTTGCTGATTTCGCTCG

    (2)DNA模板的製備  用含抗生素營養培養基篩選耐藥菌株，轉種3ml含抗生素LB培養基震蕩培養過夜，取500μl培養液於Eppendorf管中，12000r/min離心30s，棄上清，加500μl雙蒸水，振蕩混勻，置100℃水浴15min，12000r/min離心5min，上清液為DNA模板。

    (3)PCR反應  反應體係50μl，在0.5mlPCR反應管中依次加入10×緩衝液5μl，2.5mmol/L dNTPs 4μl，10pmol/L引物1和引物2各1.5μl，Taq DNA聚合酶(1U)0.5μl，模板2μl，雙蒸水補至50μl。以標準陽性菌株作陽性對照，大腸埃希菌ATCC25922作陰性對照。

    (4)反應程序  94℃預變性5min，變性1min，退火溫度72℃ 1min，30個循環，72℃延伸5min。PCR產物用2%瓊脂糖凝膠電泳，分子量100～2000bp的DNA Marker作參照，凝膠成像分析係統觀察和分析結果。大腸埃希菌ATCC25922作為陰性對照，大腸埃希菌C600(TEM/SHV1)分別作為blaTEM和blaSHV的陽性對照。

1.9  PCR產物序列分析

    擴增產物用QIA快速純化試劑盒和QIA快速凝膠提取試劑盒方法進行。使用ABI PRISM 377型測序儀對DNA測序。讀框分析、氨基酸序列推導及類似性檢索在www.ncbi.nlm.nih.gov網站的在線分析工具ORF finder和Blast對序列進行同源性分析。

    2  結果

    2.1  藥敏實驗

    KB結果顯示有2株細菌對阿莫西林/克拉維酸、亞胺培南敏感，對頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢曲鬆鈉第三代頭孢菌素耐藥，同時對氨基糖苷類及四環素耐藥，為可疑產ESBLs細菌。試驗結果表明這2株菌對CAZ、CTX、CRO等第三代頭孢菌素及AZ紙片相對於AMPC/CA紙片抑菌圈增大7～14mm，提示可能產ESBLs。

    2.2  接合傳遞實驗及質粒譜分析

    接合株E.coli 5 nonO157:H7獲得E.coli 5的全部耐藥表型。接合株E.coli 27O157:H7除SMZ/TMP外獲得E.coli 27全部耐藥表型，在E.coli 5和E.coli 27及其接合株中均發現一個大約5.8kb質粒。

    2.3  PCR擴增blaTEM和blaSHV

    E.coli 5和E.coli 27株均擴增出861bp長的blaTEM DNA片段(圖1)，未擴增出blaSHV片段(圖略)。

    2.4  DNA序列分析

    對2株blaTEM DNA的PCR產物進行基因同源性分析，發現該序列中861bp(nt1～nt861)片段與blaTEM1(GenBank注冊號：AY263331)同一性最高，達99.8%，僅在nt512處發生G→A(G512A)突變，導致在104位氨基酸出現(E104K)改變(104位穀氨酸被賴氨酸替代)。

    3  討論

    自1983年首先發現產ESBLs的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌以來，世界各地均發現產ESBLs細菌。產ESBLs細菌多為院內感染的條件致病菌，其基因類型和檢出率有很大差異，多數產生於腸杆菌科ESBLs由窄譜β內酰胺酶TEM1、SHV1編碼基因變異，可導致酶活性中心附近的氨基酸殘基被取代，改變底物結合腔的空間結構，使第三、第四代頭孢菌素、氨曲南等具有較大的空間位阻的底物進入而被水解，造成細菌ESBL種類正在不斷地增多並在不斷地進化，各種ESBLs的基因型及功能特征有一定程度的差異，同一亞群內ESBLs的功能特征相似。

    TEMESBLs在國內、外流行已發現110種，能滅活多種類型β內酰胺類抗生素。在各個國家、地區、醫院流行的亞型各不相同。美國以TEM10、TEM12和TEM26為主；英國以TEM10和TEM12為主，而法國以TEM3為主，同時還有SHV3和SHV4亞型；德國則以SHV2為主［3，5］。

    本實驗STEC美國株和中國株產ESBLs以TEM1為主，在TEM1編碼基因中第512位發生一個核苷酸的變異，導致第104位穀氨酸被賴氨酸所替代。由於賴氨酸含有一個較長的側鏈結構，其氨基與底物基團上的羧基形成靜電引力，加強了酶與底物的親和力；此外，由於構像變化，改變了酶活性位點的鍵合腔空間構型，使更複雜的新型β內酰胺類抗生素得以與酶活性中心結合，表現對廣譜、超廣譜β內酰胺類抗生素耐藥，僅對頭黴素、碳青黴素烯類敏感。2株來源不同國家的STEC具有相同特征的ESBLs基因型，並攜帶5.8kb可接合性質粒，說明STEC產ESBLs是通過質粒在同種屬細菌轉移和擴散獲得的，具有傳播氨基糖苷類等多種抗生素的耐藥特性［5，6］。

    STEC是引起大規模食源性食物中毒的主要致病菌。自1982年美國首次暴發以來，世界各地不斷有暴發和散發的報道，我國1987年在出血性結腸炎首次分離到O157：H7，1999年江蘇、安徽局部地區暴發了O157：H7的流行，流行期長，播散範圍廣，病死率高。多重耐藥STEC菌株攜帶毒力基因在自然界動物宿主中的廣泛存在，對人類構成重大威脅。產ESBL的STEC菌株的不斷出現和流行，給臨床抗感染治療帶來了更大的難度和更新的課題［6］。

    產ESBLs菌可通過接合、轉化和轉導等形式使耐藥特性在細菌間擴散，並且具有較高的交叉耐藥性和多重耐藥性，導致患者住院時間延長，費用增加，死亡率增高。同時耐藥基因在細菌間擴散，造成嚴重的醫院交叉感染和院外耐藥菌的擴散。因此應該對ESBLs細菌進行長期地檢測，建立良好的監測機製，尤其對STEC產ESBLs基因的早期監測，可了解STEC多重耐藥基因類型的變化與疫情發生發展之間的關係，避免更多的STEC耐藥株出現，對臨床合理使用抗生素，製定切實有效的預防和控製對策，防止STEC更大範圍暴發或流行有重要意義［7～9］。

 

 作者：李明成 李凡《中國抗生素雜誌》

【參考文獻】

  ［1］ Bettelheim K A, Hornitzky M A, Djordjevic S P, et al. Antibiotic resistance among verocytotoxigenic Escherichia coli and nonSTEC isolated from domestic animals and humans ［J］. Med Microbiol,2003,52:155

［2］ 倪大新，汪華，顧玲，等. 江蘇省1999年大腸埃希菌O157：H7宿主動物帶菌情況調查［J］. 中華流行病學雜誌，2002，23：102

［3］ 陳炫，呂小菊，範昕建. 超廣譜β內酰胺酶的分類和分子進化研究進展［J］. 中國抗生素雜誌，2003，28(3)：188

［4］ National Committee for Clinical Laboratory Standards. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing M100S11 ［A］. In: National Committee for Clinical Laboratory Standards ［S］. Wayne, PA,2001

［5］ 王輝，吳偉元，陳民鈞. 腸杆菌科細菌中超廣譜β內酰胺酶的研究［J］. 中華微生物學和免疫學雜誌，2001，21(6)：676

［6］ Karmele C, Javier P, Rodrigo A, et al. Simple and reliable multiplex PCR assay for detection of blaTEM, blaSHV and blaOXA1 gene in Enterobacteriaceae ［J］. FEMS Microbiol Let,2003,223(2):147

［7］ Osterblad M,Hakanen A, Manninen R, et al. A between species comparison of antimicrobial resistance in Enterobacteria in fecal flora ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2000,44:1479

［8］ Blazquez J, Morosini M I, Negri M C, et al. Selection of naturally occurring extendedspectrum TEM betalactamases variants by fluctuating betalactamase pressure ［J］. Antimicrob Agents Chemother,2000,44(8):2182

［9］ Schroeder C M, Zhao C, DeRoy C, et al. Antimicrobial resistance of Escherichia coli O157：H7 isolated from humans, cattle, swine and food ［J］. Appl Environ Microbiol,2002,68(2):576