產AmpC酶的克雷伯菌藥敏結果分析及質粒介導的AmpC和ESBLs耐藥基因檢測

【摘要】  目的 了解克雷伯菌的耐藥性及產AmpC菌株同時產ESBLs藥敏的變化。方法 采用Vitek 60型和Vitek 32型、紙片擴散法(KB法)測定42株產AmpC酶同時產ESBLs克雷伯菌的藥敏結果，並與24株產AmpC酶但不產ESBLs克雷伯菌和138株不產AmpC酶但產ESBLs的克雷伯菌藥敏結果對比分析；采用PCR分析產AmpC酶但不產ESBLs肺炎克雷伯菌的AmpC基因型。結果 產AmpC不管是否產ESBLs的克雷伯菌對亞胺培南敏感，對其他抗生素均有不同程度的耐藥；單純產ESBLs時，第四代頭孢菌素如頭孢吡肟對其活性較好，但產AmpC酶同時產ESBLs時，令頭孢吡肟幾乎失去活性。肺炎克雷伯菌產AmpC酶但不產ESBLs的20株菌中7株檢出blaDHA基因，占35%，1株檢出blaMIR基因，占5%。另外同時產AmpC酶和ESBLs的20株肺炎克雷伯菌中100%檢出blaTEM基因，90%檢出blaCTXM1基因，100%檢出blaSHV基因，85%檢出blaDHA基因，15%檢出blaMIR基因，90%檢出不同的氨基糖苷類修飾酶基因。結論 克雷伯菌產AmpC酶和同時產ESBLs的耐藥性比單純產AmpC酶的耐藥性更高、更顯著；肺炎克雷伯菌產AmpC酶的主要基因型為DHA，對同時存在2～6種不同類型耐藥基因的克雷伯菌，碳青黴烯類藥物亞胺培南的體外活性最好。

【關鍵詞】  克雷伯菌耐藥基因 AmpC ESBLs

     ABSTRACT  Objective  To investigate the drug resistance of Klebsiella and the durg susceptibilitiy variation of ESBLs and AmpC simultaneouslyproducing stains.  Methods  The drug susceptibility of 42 AmpC and ESBLs producing Klebsiella were detected by KirbyBauer motheds, Vitek 60 and Vitek 32 method. And the results were compared with those of 24 Klebsiella producing AmpC but nonproducing ESBLs and those of 138 Klebsiella producing ESBLs but nonproducing AmpC. The genotypes of AmpC were identified by PCR. Results  All AmpCproducing Klebsiella were susceptible to imipenem and different degree of resistance to other tested antibiotics. The fourth generation of cephlosporin such as cefepime had potent activities to Klebsiella, but had little activity against Klebsiella simultaneouslyproducing AmpC and ESBLs. Of 20 strains of Klebsiella producing AmpC but nonproducing ESBLs, 7 strains were detected blaDHA gene and 1 strain with blaMIR gene; blaTEMgenes were amplified in 20 strains (100%), blaCTXM1 genes were detected in 18 strains (90%), blaSHV genes were examined in 2 strains (10%), blaDHA genes in 17 strains (85%), blaMIR genes in 3 strains (15%) and three types of AMEsencoding genes were tested in 18 strains (90%).  Conclusions  The antimicrobial resisitant rates of Klebsiella simutaneoulyproducing AmpC and ESBLs are higher than that to Klebsiella producing AmpC but nonproducing ESBLs. The genotypes of Klebsiella producing AmpC are mainly DHA type. Imipenem is the first choice of the antibiotics against Klebsiella carrying 2～6 kinds of resistance genes in clinic.

    KEY WORDS  Klebsiella;  Resisitance gene;  AmpC;  ESBLs    AmpC

　　酶是由革蘭陰性杆菌產生的能使包括第三代頭孢菌素在內的許多β內酰胺酶類抗生素失活的頭孢菌素酶，既可由染色體介導，也可以由質粒介導；產ESBLs酶是質粒介導的能水解甲氧氨基β內酰胺抗生素如頭孢噻肟、頭孢他啶以及氨曲南的β內酰胺酶，它的主要類型是TEM類和SHV類，分別由blaTEM1、blaTEM2和blaSHV1基因發生單個點突變或多個點突變，導致1個或多個氨基酸改變而來［1］。自1983年德國首先發現產ESBLs的肺炎克雷伯菌以來，臨床發現產ESBLs的克雷伯菌越來越多，並且同時產AmpC酶和ESBLs的克雷伯菌也時有報道，其耐藥機製比較複雜［2］。本文僅從克雷伯菌產AmpC酶和ESBLs的特性與藥敏結果的關係進行研究，並進一步對產AmpC酶的質粒進行基因型檢測，現報告如下。

    1  材料與方法

    1.1  材料

    (1)實驗菌株  536株肺炎克雷伯菌、15株產酸克雷伯菌、3株臭鼻克雷伯菌共554株克雷伯菌分離於2000年1月至2005年12月溫州醫學院附屬第一醫院和台州市立醫院的住院患者，其中來自痰液289株，尿液111株，膿液、創麵液、分泌物、膽汁、血液、腹水、穿刺液等標本共154株。經Vitek60與Vitek32全自動細菌分析儀鑒定。同一患者同類標本多次分離到的菌株不重複計入。ESBLs檢測質控菌株肺炎克雷伯菌ATCC700603由解放軍117醫院惠贈；AmpC酶檢測質控菌株陰溝腸杆菌029M和陰溝腸杆菌1194E由中國施貴寶公司惠贈。作質粒介導的供AmpC酶的基因檢測菌株有20株，為產AmpC酶但不產ESBLs的肺炎克雷伯菌。

    (2)儀器與試劑  Vitek60與Vitek32全自動細菌分析儀，GNS506、GNS120藥敏檢測卡均為法國BioMerieux公司產品，藥敏紙片為英國Oxoid公司產品，MH瓊脂為浙江杭州天和微生物公司產品。PCR基因擴增試劑盒為無錫市克隆遺傳研究所產品，DNA Marker為Fermentas公司提供，瓊脂糖凝膠為美國Promega公司產品。

    1.2  方法

    (1)酶液提取  挑取血平板上過夜培養的數個菌落加入12ml胰腖肉湯，置於35℃恒溫搖床上(200r/min)孵育4～6h，4℃ 4000r/min離心25min。去沉澱物置-80℃反複凍融5次，1.5ml 0.01mol/L PBS(pH7.4)漩渦混勻，4℃ 9000r/min離心1h，去上清液即為酶提取液。

    (2)ESBLs檢測  采用酶提取物三維試驗。根據ESBLs能水解第三代頭孢菌素，但不能被氯唑西林抑製的特點，參考文獻［3］操作，按標準紙片擴散法操作，取相當於1.5×108CFU/ml的標準大腸埃希菌ATCC25922菌液，接種MH瓊脂平板，平板中心貼一片30μg頭孢曲鬆(CRO)紙片，再距紙片中心5mm放射狀切四條狹縫，將40μl的酶提取液加入狹縫內，用36μl酶提取液加上4μl 2mol/L氯唑西林取代40μl的酶提取液加入另一狹縫，餘狹縫加陰性和陽性對照，35℃孵育過夜，若狹縫與抑菌環交界處出現生長區域，視為三維試驗陽性，即ESBLs陽性。肺炎克雷伯菌ATCC700603為ESBLs陽性對照，大腸埃希菌ATCC25922、陰溝腸杆菌029M為ESBLs陰性對照。

    (3)AmpC酶檢測  按參考文獻［3］操作，將1.5×108CFU/ml的大腸埃希菌ATCC25922菌液密塗於MH瓊脂平板，稍幹後在平板中心貼一片30μg的頭孢西丁紙片。用無菌刀片在離紙片5mm處放射狀的切一條狹縫，用微量加樣器加樣品25μl酶提取液加入狹縫內，避免酶液溢出狹縫，待酶液稍幹後置於35℃孵育箱內過夜。若在狹縫與抑菌環的交界處出現擴大的長菌區域，判為三維試驗陽性，即AmpC酶陽性。

    (4)藥敏試驗  Vitek60型和Vitek32型全自動細菌分析儀及KB瓊脂擴散法檢測細菌的藥敏結果，嚴格按照要求操作，並參考CLSI/NCCLS(2004年)標準判斷結果。質控菌株為大腸埃希菌ATCC25922。

    (5)基因檢測

    質粒AmpC酶基因檢測  每反應體係P1、P2引物各0.5μl，Taq DNA酶1U，dNTP、擴增緩衝液、Mg2+等按常規PCR配比加入，總反應體積20μl，其中模板5μl。擴增參數：93℃預變性2min，93℃變性30s，55℃褪火30s，72℃延伸60s，循環35個周期，最後一個循環72℃延長至5min。PCR產物檢測經1.5%瓊脂糖凝膠電泳(已加入溴化乙錠)，出現與陽性對照分子相當的條帶，並與DNA Marker相比較分析，陽性對照DHA為DHA1型陰溝腸杆菌。MIR為MIR型陰溝腸杆菌，純水為陰性對照。AmpC酶基因PCR擴增使用引物序列見表1。

    PCR擴增  PCR引物序列見表2。與ESBLs有關的基因blaCTXM1群引物能擴增CTXM1、3、6、7、10、TOHO1群編碼基因，blaCTXM2群引物能擴增CTXM2、4、5群編碼基因，blaCTXM3群引物能擴增CTXM 8、9群編碼基因。擴增體係為每反應係P1、P2引物各0.5μmol，KCl 10mmol/L，(NH4)2SO4 2mmol/L，MgCl2 2mmol/L，TrisHCl (pH9.8) 10mmol/L，NP40 0.5%，BSA 0.02%，Taq DNA聚合酶1U。總反應體表1   AmpC酶基因PCR擴增引物表2   ESBLs、AMEs酶基因PCR引物序列積為20μl，其中模板液5μl。與氨基糖苷類修飾酶(AMEs)有關的基因引物aac(3)II、aac(6′)I、ant(3")I與質粒介導的AmpC有關的基因引物blaDHA、blaMIR引物的擴增參數：93℃預變性2min，93℃變性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，35個循環。最後一個72℃延長至5min。與ESBLs有關的基因blaTEM、blaCTXM1群、blaCTXM2群、blaCTXM1群、blaSHV、blaPER引物擴增參數為：93℃預變性2min，93℃變性60s，55℃退火60s，72℃延伸60s，35個循環，延伸5min。PCR產物檢測經1.5%～2%瓊脂糖凝膠電泳(已加入溴化乙錠)，出現於陽性對照分子相當的條帶，並與DNA Marker相比較分析，純水為陰性對照。陽性對照CTXM1群為CTXM3型大腸埃希菌，CTXM2群為CTXM5型大腸埃希菌，CTXM3群為CTXM9型大腸埃希菌，SHV為SHV2型大腸埃希菌，PER為PER1型銅綠假單胞菌，DHA為DHA1型陰溝腸杆菌。MIR為MIR陰溝腸杆菌，aac(6′)I為鮑曼不動杆菌(AY536033)，aac(3)II為肺炎克雷伯菌(AY553610)，ant(3")I為鮑曼不動杆菌(AY551438)［4］。

    (6)藥敏結果統計學處理  用SPSS13.0作χ2檢驗。

2  結果

    2.1  克雷伯菌分類及產AmpC酶產ESBLs情況

    554株克雷伯菌中肺炎克雷伯菌占96.75%，產酸克雷伯菌占2.71%，臭鼻克雷伯菌占0.54%；產AmpC酶66株，陽性率為11.91%；產ESBLs 180株，陽性率為32.49%，其中既產AmpC又產ESBLs的有42株，陽性率為7.58%。

    2.2  產AmpC酶同時產或不產ESBLs菌株的藥敏

    (1)產AmpC酶同時產ESBLs菌株的藥敏結果與產AmpC酶但不產ESBLs菌株的藥敏結果見表3。

    (2)產AmpC酶同時產ESBLs的藥敏結果與不產AmpC酶但產ESBLs的藥敏結果見表4。

    2.3  基因型

    (1)肺炎克雷伯菌產AmpC酶但不產ESBLs 20株檢測到產物長度為405bp的blaDHA基因有7株，檢出率35%(7/20)，檢測到產物長度為302bp的blaMIR基因有1株，檢測率5%(1/20)；未檢測到其它基因。它們的表型與AmpC基因型見表5。

    (2)肺炎克雷伯菌產AmpC酶同時產ESBLs 20株菌β內酰胺類藥物的耐藥表型和基因型檢測結果見表6。

    (3)肺炎克雷伯菌產AmpC酶同時產ESBLs 20株菌的AMEs基因型分型見表7。

    3  討論

    (1)AmpC酶和ESBLs是介導革蘭陰性杆菌耐藥的最主要兩種酶，它們均能水解第三代頭孢菌素，但兩者又有重要區別，ESBLs可被β內酰胺酶抑製劑所抑製，不被氯唑西林抑製，且大部分產ESBLs菌對頭孢西丁敏感；AmpC酶則不被β內酰胺酶抑製劑所抑製，可被氯唑西林抑製，產酶株對頭孢西丁耐藥，因此準確檢測和區分這兩類酶對臨床選擇用藥有重要意義［5］。  表3 克雷伯菌產AmpC同時產ESBLs與產AmpC酶但不產ESBLs的藥敏結果比較表4  肺炎克雷伯菌產AmpC酶同時產ESBLs株與不產AmpC酶但產ESBLs株的藥敏結果比較近年來由於質粒介導AmpC酶的出現［6］，導致耐藥性的廣泛傳播。質粒介導的AmpC酶是1988年由美國發現，它與染色體介導的AmpC酶不同，可以高水平持續表達，可通過轉化、接合等方式轉移給其它細菌而造成耐藥性的廣泛傳播。除DHA1型外，大多數質粒型AmpC酶是不可誘導的［4，7］。

    (2)對於頭孢菌素來說，由於產AmpC酶和不產ESBLs陰性的菌株均能水解第三代頭孢菌素(如表3所示)，其耐藥率都很高(65%～72%)，而產AmpC酶表6 肺炎克雷伯菌產AmpC酶同時產ESBLs對β內酰胺類藥物的耐藥表型和基因型檢測結果表7    肺炎克雷伯菌產AmpC酶同時產ESBLs20株菌的AMEs基因型分型同時產ESBLs的菌株耐藥性更高(幾乎達100%)；對AmpC酶穩定的頭孢吡肟［8］在單純產AmpC酶的菌株中耐藥率達54.2%，在雙重產酶株中其耐藥率達85.7%。從表3可以看出，產AmpC酶同時產ESBLs菌株的藥敏結果，除第一代頭孢菌素(如頭孢唑林)無差異外，其它耐藥率明顯高於單純產AmpC酶的菌株，兩者有極顯著性的差異。從表4可以看出，當單純產ESBLs時，頭孢吡肟有較好的活性，但當產AmpC同時產ESBLs時，頭孢吡肟幾乎失去活性。頭孢唑林也類似，但頭孢曲鬆、頭孢他啶卻100%耐藥。

    (3)從表3還可以看出，AmpC酶幾乎不能被含有克拉維酸的酶抑製劑所抑製，但含有三唑巴坦和舒巴坦的酶抑製劑對AmpC酶有一定的抑製作用，這與文獻［9，10］報道的結果一致；對氨基糖苷類來說，阿米卡星、慶大黴素對雙重產酶株與單純產AmpC酶菌株的藥敏結果無差異，而妥布黴素卻有顯著差異。妥布黴素對雙重產酶株有一定的抑菌作用，但對單純產AmpC酶菌株效果不佳；對喹諾酮類藥物左氧氟沙星、環丙沙星來說，雙重產酶株的藥敏結果比單純產AmpC酶菌株效果還好，兩者有顯著性差異，其中原因需進一步研究。

    (4)對於碳青黴烯類亞胺培南，不管是否產AmpC酶還是產ESBLs酶，它的耐藥率總為0，所以說碳青黴烯類是治療產AmpC酶和ESBLs的克雷伯菌的首選藥物，並且是最好的藥物；對頭黴素藥物頭孢替坦等，雖然它們的耐藥率也很低，但由於它們有很強的誘導DHA型質粒AmpC酶的作用，臨床也很少選用。

    (5)對產AmpC酶但不產ESBLs的肺炎克雷伯菌的ampC基因檢測的結果來看，blaDHA基因是肺炎克雷伯菌的產AmpC酶的主要基因。對20株產AmpC酶和同時產ESBLs的肺炎克雷伯菌耐藥基因檢測，75%菌株同時檢測到ESBLs基因型TEM、CTXM1及AmpC基因型DHA；20株菌中100%菌株檢測到基因型TEM，10%菌株檢測到ESBLs基因型SHV、DHA，90%檢測到CTXM1，15%檢測到MIR，提示在浙江的溫州和台州地區存在基因型TEM、CTXM1 ESBLs和DHA基因型AmpC流行。  

             

 作者：王冬國 周鐵麗  《中國抗生素雜誌》

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