厚樸內生真菌的研究（Ⅰ）：菌種分離及其鑒定

摘要：從兩個不同來源的厚樸Magnolia officinalis Rehd. et Wils.的莖中，分離獲得內生真菌48株，經顯微形態觀察，鑒定為1綱、3目、6科、16屬。不同來源的厚樸內生真菌的種群、數量及分布部位存在顯著差異。

　　關鍵詞：厚樸；  內生真菌；  多樣性

　　Study on Endophytic Fungi in Magnolia officinalis Rehd. et Wils.（Ⅰ）:Isolation and Identification of Endophytic Fungi

　　　Abstract：48 strains of endophytic fungi were isolated from the stem of Magnolia officinalis Rehd. et Wils. They were morphologically identified belonging to 16 genera, 6 families, 3 orders and 1 class. The result of the experiment has shown that quantity, species and distributing of the endophytes varied in Magnolia officinalis Rehd. et Wils. of different habitat.

　　Key words：Magnolia officinalis Rehd. et Wils.；  Endophytic fungi；  Diversity

　　厚樸Magnolia officinalis Rehd. et Wils. 是著名的川產道地藥材, 屬國家二級保護的珍惜瀕危藥用植物。用於濕滯傷中，脘痞吐瀉，食積氣滯，腹脹便秘，痰飲咳喘等病症［1］。厚樸多以複方入藥，用量較大；而厚樸原植物生長周期長，曾出現厚樸資源匱乏，采用環剝技術確保進行了枝皮剝除的植株能繼續生長的方法來保存資源的現象。現在厚樸雖已進行大麵積規模化種植，但從長遠觀點看，厚樸資源仍顯不足。植物內生真菌能夠產生與宿主相同或相似化學成分這一特性在一定程度上可以緩解植物資源短缺問題。厚樸內生真菌的研究未見報道。筆者對厚樸內生真菌進行了菌株分離、鑒定等工作。現將研究結果報道如下。

　　1  材料與方法

　　1.1  材料

　　1.1.1  來源 采集四川峨眉山唐山健康植株的枝條；四川都江堰市虹口鄉健康植株的枝條作為樣本。原植物經鑒定為厚樸Magnolia officinalis Rehd. et Wils.。

　　1.1.2  培養基  PDA培養基（馬鈴薯培養基）（用於培養）、PDA培養基＋青鏈黴素混和液（用於分離）、查氏培養基（NaNO3，K2HPO4，KCl，MgSO4，FeSO4，蔗糖）（用於鑒別）、促孢培養基（KH2PO4，KNO3，MgSO4・7H2O，KCl ，澱粉，葡萄糖，蔗糖）（用於鑒別）。

　　1.2  方法

　　1.2.1  內生真菌的分離用自來水將新鮮植物表麵洗淨，稍幹後切成適宜長度的小段，在75％酒精中浸泡3～5 min，用無菌水衝洗3～4次，無菌濾紙吸幹。然後用無菌刀片將組織表皮削去，分別取韌皮部、木質部和髓部切成5 mm×5 mm×1 mm的小塊貼放於分離培養基上，置25～28℃恒溫箱中培養3～20 d，待培養基上各植物組織周圍長出菌絲後，采用尖端菌絲挑取法對所分離的內生真菌進行純化，即得內生真菌。

　1.2.2  內生真菌的鑒定采用插片培養和點植法，對分離獲得的銀杏內生真菌進行顯微形態特征的觀察、分類鑒定。分類檢索參照文獻［2,3］。

　　2  結果與討論

　　2.1  厚樸內生真菌種群多樣性分析 從厚樸中共分離出48株內生真菌，經顯微形態觀察，鑒定為1綱、3目、6科、16屬。厚樸內生真菌種群組成見表1。

　　表1   厚樸內生真菌種群組成（略）

　　由表1可以看出，厚樸內生真菌在種類上存在著極其豐富的多樣性特征。在厚樸內生真菌中，從數量上看，以曲黴屬（Aspergillus）、青黴屬（Penicillium）和鐮孢屬（Fusarium）為優勢種群，包含菌株分別占總菌株數的31.3％，18.8％，14.6％。部分屬種代表性顯微形態特征參見圖1～6。

　　2.2  不同采集地點厚樸內生真菌的分布從不同地點采集的厚樸植株中均分離到了一定數量、不同類群的內生真菌，表明內生真菌在厚樸體內廣泛存在。不同采集地的厚樸中內生真菌的優勢菌群不同。其中，采集於峨眉山唐山的厚樸優勢菌群為青黴屬（Penicillium）；采集於都江堰市虹口鄉的厚樸優勢菌群為曲黴屬（Aspergillus）。結果見表2。

　　圖1  葡萄孢Botrytis sp.顯微特征（略） 

　　圖2  鐮孢菌Fusarium sp.顯微特征（略）

　　圖3 阜孢黴Papularia sp.顯微特征 （略）

　　圖4 膠帚黴Gliocladium sp.顯微特征（略）

　　圖5  曲黴Aspergillus sp.顯微特征 （略）

　　圖6  青黴Penicillium sp.顯微特征（略）

　　由表2可以看出，采集於峨眉山的厚樸植株中的內生真菌在種類上較之采自都江堰者顯得豐富，兩地植株中分離出的內生真菌數量相當。鐮孢屬（Fusarium）為不同來源厚樸植株的共有菌群，而兩地植株的優勢菌群也成為各自的特有菌群之一。

　　表2   不同采集地點厚樸內生真菌數量及種類分布情況（略）

本次實驗從兩個不同來源的厚樸中共分離到48株內生真菌，經鑒定為1綱、3目、6科、16屬，顯示出該植物內生真菌在種類和數量上的多樣性。采自不同地點的厚樸植株內生真菌種群差異較為明顯，采集於峨眉山唐山的厚樸優勢菌群為青黴屬（Penicillium），而采自都江堰市虹口鄉的厚樸優勢菌群為曲黴屬（Aspergillus）。鐮孢屬（Fusarium）是不同來源厚樸植株的共有菌群。采集於峨眉山的厚樸植株中的內生真菌在種類上較之采自都江堰者顯得豐富。我們認為這與采集地的具體環境及厚樸的樹齡有關。樹齡較長的植株能夠提供給微生物一個相對較長的與宿主之間的“磨合期”，使一些致病菌轉變成暫時不致病的內生菌，內生真菌的種類也就相對較多。這再一次表明，植物內生真菌的數量和種類與植物自身狀況及其所處環境密切相關。有關厚樸內生真菌中活性菌株的篩選研究，將在隨後的文章中給予報道。

作者：龐蕾， 嚴鑄雲， 郭曉恒， 羅靜， 萬德光  《時珍國醫國藥》

　　參考文獻：

　　［1］  國家藥典委員會. 中國藥典，Ⅰ部［S］.北京：化學工業出版社，2005：176.

　　［2］  魏景超. 真菌鑒定手冊［M］.上海：上海科學技術出版社，1979.

［3］  H. L巴尼特，B. B亨特著，沈崇堯譯. 半知菌屬圖解［M］.北京：科學出版社，1977

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