金黃色葡萄球菌食物中毒病原檢測及方法比較

［摘要］目的：可疑金黃色葡萄球菌食物中毒事件病原學檢測，傳統的分離培養與熒光PCR檢測方法的方法比較 。方法：本實驗采用國家標準方法對食物中毒標本進行金黃色葡萄球菌分離培養，並對食物中毒標本及分離的陽性菌株作腸毒素定性測定；用熒光PCR(FQPCR)方法對可疑食品及患者嘔吐物標本進行金黃色葡萄球菌快速檢測。 結果：用國標方法，9份嘔吐物標本中7份分離出金黃色葡萄球菌，陽性率77.78%，熒光PCR快速法檢測相同標本，9份嘔吐物均呈陽性，陽性率100%，食品鹵香幹檢出金黃色葡萄球菌，8個陽性菌株C型腸毒素檢出率100%。結論：該中毒確診為金黃色葡萄球菌C型腸毒素中毒，中毒食品為鹵香幹。熒光PCR檢測法快速、靈敏，尤其適用於藥後患者標本及已加熱殺菌的可疑中毒食品的檢測，作為初篩、輔助診斷手段，在食物中毒病原檢測中值得廣泛推廣。

 

　　［關鍵詞］  金黃色葡萄球菌；腸毒素；病原診斷；溯源

 

　　金黃色葡萄球菌是國內外最常見的細菌性食物中毒病原之一，在我國，由金黃色葡萄球菌引起的食物中毒約占細菌性食物中毒事件的25%，而在美國、加拿大等發達國家，更是高達50% 。該菌引起中毒的主要原因是產生耐熱腸毒素，100　℃加熱1.5 h仍不失去其活性［1］。因此，金黃色葡萄球菌一旦汙染食品並在其產生腸毒素，普通的烹飪方法不能將其破壞，因而食品一旦被金黃色葡萄球菌汙染極易引起食源性疾病的爆發。2005年8月，我市也發生了一起由於食用從某大型超市購買的鹵菜而引起的食物中毒，中毒24人，經現場流行病學調查、患者臨床症狀及實驗室病原診斷，證實為一起金黃色葡萄球菌腸毒素中毒。現將病原檢測情況報告如下。

 

　　1　材料與方法

 

　　1.1　標本　患者嘔吐物9份，可疑中毒食品涼拌豆筍、鹵鴨掌、鹵香幹各1份，分別編號1～12。

 

　　1.2　實驗設備、檢測試劑及培養基　熒光PCR儀(美國MJ opticon2)、金黃色葡萄球菌DNA檢測試劑盒(達安基因提供)、金黃色葡萄球菌腸毒素RPLA(反相被動膠乳凝集實驗)試劑盒(OXOIDTD0900)、7.5%氯化鈉肉湯、胰蛋白腖大豆肉湯、BairdPark瓊脂、血瓊脂、凍幹兔血漿、微量甘露醇發酵管。所有試劑及培養基均在效期內使用，實驗室室內質控和室間質評均符合要求。

 

　　1.3　菌株分離　按國標方法［2］稱取25 g檢樣加入225 ml滅菌生理鹽水中，均質器混勻後吸取5 ml接種於50 ml 7.5%氯化鈉肉湯36 ℃±1 ℃增菌24 h，轉種BairdPark(BP)瓊脂36 ℃±1 ℃培養24 h後，挑取可疑菌落染色鏡檢、轉種血瓊脂平皿及做血漿凝固酶實驗、甘露醇發酵實驗。金黃色葡萄球菌在BP瓊脂上形成圓形、光滑、突起、濕潤的灰黑色菌落，菌落周圍有一渾濁帶，外層有一透明圈。

 

　　1.4　金黃色葡萄球菌DNA定性檢測　依試劑盒說明，0＜Ct≤35判陽性，Ct=0為陰性。

 

　　1.5　腸毒素檢測　將分離得到的菌落接種至胰蛋白腖大豆肉湯36 ℃±1 ℃培養18 h～24 h，患者嘔吐物標本、可疑中毒食品可直接取樣10 g加入10 ml生理鹽水，均質器混勻，900 g、4 ℃離心20 min，取上清用0.25 μm～0.45 μm微孔濾膜過濾，保留濾液作反相被動膠乳凝集實驗(RPLA)，檢測A、B、C、D四型腸毒素。

 

　　2　結果與分析

 

　　12個標本檢測結果見表1。

 

　　表1　12個標本各項檢測結果(略)

 

　　注：標本4、6為用藥1天後患者標本＋：陽性-：陰性±：可疑

 

　　2.1　FQPCR快速金黃色葡萄球菌　樣品中直接提取DNA9份嘔吐物標本陽性率100%，3份可疑中毒食品中12號鹵香幹DNA檢測呈陽性。從樣品處理至出初步結果曆時約4 h。

 

　2.2　分離培養法　9份嘔吐物標本7份分離金黃色葡萄球菌，陽性率77.78%，可疑中毒食品鹵香幹亦分離出金黃色葡萄球菌。

 

　　2.3　腸毒素檢測與分型

 

　　2.3.1　直接從樣品中檢測腸毒素　3份嘔吐物標本及鹵香幹檢出C型腸毒素。

 

　　2.3.2　陽性菌株接種產毒培養基增菌後檢測腸毒素　7份嘔吐物和鹵香幹中分離的8株陽性菌C型腸毒素檢出率100%。

 

　　3　討論

 

　　3.1　建立快速、準確診斷食物中毒病原菌的檢測方法是有效控製食物中毒的重要手段　目前，國內金黃色葡萄球菌食物中毒病原診斷的金標準仍然是細菌的成功分離，通過增菌、分離培養、生化鑒定等一係列步驟來完成，靈敏度低，操作較煩瑣，耗費時間長。應用熒光PCR技術則彌補了這個缺點，靈敏、快速、特異、操作簡單［3］，尤其適用於無活菌或含菌量低的用藥後患者標本及已加熱殺菌的可疑中毒食品的檢測。本次實驗結果顯示，FQPCR檢測金黃色葡萄球菌的陽性率與分離培養法的陽性率有較好的伴隨關係，檢測時間由傳統方法的4 d縮短到4 h，證明熒光PCR檢測結果可信、快速，但正因為其高度的敏感性，而外環境中金黃色葡萄球菌的普遍存在，使檢測過程中易受外環境的汙染而造成假陽性，所以隻有結合兩種方法的優點，把常規培養法與FQPCR法相結合，把熒光PCR技術作為初篩、輔助診斷手段，為早期診斷及最後確診病原指明方向，避免在檢測中犯方向性錯誤而浪費更多的時間延誤診斷。

 

　　3.2　金黃色葡萄球菌中毒的實質是耐熱腸毒素中毒，隻有檢測出腸毒素，才能為金黃色葡萄球菌中毒下最後的定義［4］，實驗結果顯示：RPLA直接檢測標本中金黃色葡萄球菌腸毒素不夠靈敏，最好將分離到的陽性菌株接種到產毒培養基(胰蛋白腖大豆肉湯等)36　℃±1　℃培養18 h~24 h再行檢測。

 

　　3.3　另外，本實驗室在用BP瓊脂選擇性培養金黃色葡萄球菌時，因晚上停電(停電時段不明)，溫箱內溫度降低，培養24 h後觀察菌落時，形態特征不明顯，“菌落周圍有一渾濁帶及外層有一透明圈”這一典型鑒別特征不清晰，放回溫箱36 ℃±1 ℃繼續培養約4 h後，才出現典型特征。可見，在金黃色葡萄球菌分離培養中，培養溫度和時間一定要充分達到要求，否則容易漏檢。

 

　　3.4　本次食物中毒從病原學角度可診斷為金黃色葡萄球菌　C型腸毒素中毒，中毒食品為本市某大型超市出售的散裝涼菜鹵香幹。當前，食源性疾病已越來越受到各級政府的高度關注，作為控製食源性疾病主力軍的衛生監督、疾控部門，應加大監管力度，從根本上著手，堅決打擊取締不顧公共食品安全的不法商販、地下黑作坊，防止危害公共健康的食源性疾病的發生。

 

　　參考文獻:

 

　　［1］　張文治.新編食品微生物學［M］.北京：中國輕工出版社，1995.

　　［2］　GB/T4789.102003，食品衛生微生物學檢驗［S］

　　［3］　張蓓，沈立鬆.實時熒光定量PCR的研究進展及其應用［J］.國外醫學臨床生物化學與檢驗冊，2003，24(6):327328.

　　［4］　雷祚榮.葡萄球菌和葡萄球菌毒素病［M］. 北京：中國科學技術出版社，1992.