耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥性分析

【摘要】  目的：分析耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(MRSA)檢測方法及其耐藥性。方法：采用頭孢西丁紙片法和PCR兩種方法檢測臨床分離的60株金黃色葡萄球菌中MRSA菌株;紙片擴散法測定金黃色葡萄球菌對15種抗菌藥物的敏感性。結果：紙片法及PCR法對MRSA檢出率分別為15%、13.3%,兩種方法對MRSA檢出率差異無統計學意義（P＜0.05）。以PCR法檢出mecA、femB基因為判斷MRSA的金標準。除了替考拉寧、萬古黴素以外,其餘抗生素的耐藥率MRSA組均明顯高於MSSA組(P<0.01)。結論：頭孢西丁紙片法是篩選和確認MRSA菌株的一種可靠、簡便的方法;MRSA為多重耐藥菌株,臨床應加強檢測。

 

【關鍵詞】  耐甲氧西林;金黃色葡萄球菌,R4/E3C

 

　　Study on insecticide tolerance of Methicillin resistant Staphylococcus aureus

 

　　FANG Qiang

 

　　Department of Bioengineering, Changchun Industry University, Changchun 130012, China

 

    Abstract: Objective  To analyze differentiate of detecting Methicillin resistant Staphy lococeus aureus ( MRSA) and investigate the changes of antimicrobial susceptibility of staphylococcus aureus in order to guide a reasonable use of antibiotics. Methods  Sixty strains of S. aureus isolated from clinical specimens were tested for K-B to 15 antibiotics. Results   The isolate rate of K-B and PCR method was 15% and 13.3%,respectively, which there was not significant difference (P>0.05). The double-PCR was goaden criterion for MRSA. Except for Vancomyem and Teicoplanin , the susceptiblility of MRSA was lower than MSSA. Conclusion    K-B for Cefoxitin is a reliable and convenient method. Surveillance of the susceptibility of provincial S. aureus to antimicrobial agents is of great importance to both rational use of antibiotics and reduction of resistant strains.

 

    Key Words：Staphylococcus aureus; Susceptibility; Antimicrobial agents

 

    耐甲氧西林金黃色葡萄球菌目前已經成為院內感染的主要病原菌，並逐漸擴展到社區，與艾滋病、病毒性乙型肝炎並列成為世界三大感染性疾病，嚴重威脅著人類的健康。及時準確的檢測MRSA，並合理應用抗菌素，采取嚴格的隔離和消毒措施，對於控製MRSA院內暴發流行，限製向社區蔓延是十分必要的。

 

　　1   材料與方法

 

　　1.1  菌株來源：為我研究中心收集的2005 年1 月～2005 年12 月吉林省人民醫院60 例住院患者各種細菌標本。MRSA 醫院感染的診斷按《臨床醫院感染學》確定［1 ］ 。質控菌株金黃色葡萄球菌ATCC25923、ATCC29213 均購自衛生部臨床檢驗中心。

 

　　1.2  抗生素紙片及培養基：抗生素紙片均購自北京天壇藥物生物技術公司;血瓊脂、巧克力瓊脂等平板購自天津賽淩科技服務有限公司;藥敏試驗的M - H 瓊脂平板由杭州天和微生物試劑有限公司提供的M - H 瓊脂粉按說明要求溶解、滅菌、配製。

 

　　1.3  細菌鑒定：細菌的分離和培養按《全國臨床檢驗操作規程》(第2版) 進行;細菌鑒定采用法國生物梅裏埃API staph 鑒定係統和手工法。

 

　　1.4  MRSA株的檢測(采用K-B法)：在M-H瓊脂中加入2%～4%NaCl溶液,35℃,培養24h,采用較穩定的頭孢西丁紙片代替甲氧西林,如金黃色葡萄球菌的抑菌環≤19mm,判定為MRSA株。

 

　　1.5  mecA～femB雙重PCR體係及擴增條件［2］：94℃預變性4min，94℃變性45s，50℃退火45s，72℃延伸60s，進行30次循環，最後72℃延伸2min，反應結束後，將PCR產物於4℃保存。mecA和femB基因擴增引物見表1，參照JonasD［3］等報道設計，由上海生物工程有限公司合成。表1  PCR擴增mecA和femB基因所用引物（略）

 

　　1.6  藥敏試驗：采用K-B法,其操作及結果判定按照美國國家臨床實驗室標準委員會(NCCLS)頒布的規則(2000年版)進行［1］。

 

　　2  結果

 

　　2.1  K-B法檢測MRSA：60株金黃色葡萄球菌通過K-B法檢測MRSA，結果有9株為MRSA，51株為MSSA。

 

　　2.2  MRSA確證試驗：mecA～femB雙重PCR對K-B法檢測的9株MRSA進行確證試驗，其中8株為MRSA，另一株為mecA陰性，femB陽性，為MSSA。表2  mecA、femB基因在不同種類葡萄球菌中的表達（略） 注：MRSA－苯唑西林耐藥的金黃色葡萄球菌；MSSA－苯唑西林敏感的金黃色葡萄球菌；MRSCoN－苯唑西林耐藥的凝固酶陰性葡萄球菌；MSSCoN－苯唑西林敏感的凝固酶陰性葡萄球菌

 

　　2.3  對8株MRSA進行藥敏試驗：結果如表3。表3  8株MRSA的耐藥情況（略）注：M：100bp DNA ladder marker；1：MRSA陽性對照株（協和醫院細菌室提供）的PCR擴增產物；2：MSSA（ATCC25923）的PCR擴增產物；3-13：MRSA株的PCR擴增產物。

 

　　3  討論

 

    對MRSA的檢測，除檢驗科常用、快速的紙片擴散法外，根據文獻報道（原理見表2），還需要進行mecA～femB雙重PCR確證試驗。本研究對K-B檢測的9株菌再次進行確證試驗，結果發現其中1株為MSSA。

 

    MRSA的分離率與不同時期、不同地域及抗生素選擇壓力不同等多種因素有關，但總體來說，呈緩慢上升趨勢。本研究調查的5家教學醫院中，MRSA平均分離率為53.9％，高於李家泰［4］於2000年～2001年對我國13家醫院監測的平均分離率（37.4％）。其中上海中山醫院MRSA分離率最高（79.5％），這與2004年汪複［5］教授等人對上海地區14家醫院監測的結果63.9％（56.0％～86.5％）接近；武漢最低（31.6％）；浙江與武漢接近，為35％，基本接近張紹銀［6］報道的結果（43.2％）。

 

    另外，MRSA的危害性更嚴重的表現在對多種藥物的多重耐藥性，特別是β－內酰胺酶陽性的菌株，其耐藥頻率更高。表1中可以看出，MRSA對許多抗生素包括青黴素G、頭孢類、大環內酯類、四環素類、單一抗生素類的慶大黴素、克林黴素等均表現為大於90％耐藥，對於常用抗生素利福平也有不同程度的耐藥，即使體外藥敏敏感，但治療效果不理想。唯獨萬古黴素、替考拉寧對其有100％敏感。MSSA對青黴素也有90％以上耐藥，對紅黴素和克林黴素的敏感率也已經降低至30％～60％，對奎諾酮類抗菌藥物的敏感率已經低於90％，對頭孢類抗菌藥物還保持90％左右的敏感。由此可見，如果長期大量的濫用抗菌藥物，即使是MSSA，耐藥譜也會逐漸擴大。所有金黃色葡萄球菌對萬古黴素和替考拉寧仍表現為100％敏感。目前，萬古黴素是治療MRSA感染的首選藥物。但是，一旦大量使用萬古黴素，又有潛在的耐萬古黴素菌株出現的可能。自2002年美國報道了第1株耐萬古黴素的金黃色葡萄球菌以來，先後出現3株VRSA［7］。我國尚無耐萬古黴素金葡菌的報道。如萬古黴素對MRSA治療無效，那麽後果不堪設想。

 

    總之，快速、準確的檢測MRSA，及時監測耐藥譜，對發生MRSA暴發流行的控製，知道臨床實踐具有重要意義。

作者：房強    作者單位：長春工業大學生物工程學院，吉林 長春 130012

 

【參考文獻】

  　　［1］山東省衛生廳.醫院感染管理手冊［M］.濟南:山東科學技術出版社,2000：53-69.

　　［2］Daum RS, Ito T, Hiramatsu K, et al. A novel Methicillin resistance cassette in community acquired Methicillin resistant Staphylococcus aureus isolates of diverse genetic backgrounds［J］. J Infect Dis，2002，186:134.

　　［3］Berger Bachi B. Expression of resistance to methicillin［J］. Trends Microbiol, 1994,2:389.

　　［4］李家泰，李 耘，王 進.中國醫院和社區獲得性感染革蘭陽性球菌耐藥性監測研究［J］.中華醫學雜誌，2003，83（5）：365.

　　［5］德 妹，汪 複，張嬰元.2004年上海地區細菌耐藥性監測［J］.中國抗感染化療雜誌，2005，5（4）：195.

　　［6］張紹銀.846株金葡菌中耐甲氧西林葡萄球菌的分離結果及耐藥性分析［J］.實用醫學雜誌，2005，21（3）：257.

　　［7］Fred C，Tenover，McDonald LC. Vancomycin－resistant staphylococci and enterococci：epidemiology and control［J］.Curr Opin Infect Dis,2005,18：300.