產ESBLs肺炎克雷伯菌的耐藥基因譜及遺傳學特征

【摘要】  目的： 了解產ESBLs肺炎克雷伯菌的耐藥基因譜及其遺傳學特征。方法：對35株產ESBLs肺炎克雷伯菌，采用聚合酶鏈反應(PCR)檢測 aac（3）-Ⅰ,aac（3）-Ⅱ,aac（6′）-Ⅱ,ant（3″）-Ⅰ,ant（2″）-Ⅰ，aac(6′)-Ⅰ，aac(6′)-Ⅰb等7種氨基糖苷類修飾酶基因，TEM,SHV,LEN,OKP,CTXM-1,CTXM-2,CTXM-9,GES,PER,VEB,OXA-10,OXA-1,OXA-2,DHA,ACT-1等15種β-內酰胺酶基因，intI1,intI2,intI3等3種整合子基因，tnpA（TnA轉座子標記）,merA（Tn21/Tn501轉座子標記），qacEΔ1-sul1消毒劑耐藥基因，qnr喹諾酮類耐藥基因，共檢測29種耐藥基因並對部分產物進行測序。結果： 35株肺炎克雷伯菌中檢出β-內酰胺酶基因22株，陽性率62.9%。整合子基因陽性22株，陽性率62.9%。氨基糖苷類修飾酶基因陽性26株，陽性率74.3%。tnpA全部陰性。merA 陽性2株，陽性率5.7%。qacEΔ1-sul1陽性13株，陽性率37.1%。qnr全部陰性。在測序中發現一種新的基因型，並以aac(6′)-Ⅰb-Suzhou型命名，登錄於美國NCBI(登錄號：EF375621)。結論： 產ESBLs肺炎克雷伯菌的耐藥基因及耐消毒劑基因的攜帶率非常高，耐藥基因譜及其遺傳學特征非常複雜。

 

【關鍵詞】  肺炎克雷伯菌； 耐藥基因； 遺傳學特征

 

［基金項目］ 蘇州市科技計劃項目（蘇科計SZD0622）

 

　　Resistance gene spectrum and genetics characteristics　of klebsiella pneumoniae producting ESBLs

 

　　XU Wei-dong, XU Hong-xing,  MI Zu-huang, CHEN Zhao-hua, WU Yuan-jian

 

　　(Department of Clinical Laboratory, the Affiliated Suzhou Municipal Hospital of Nanjing Medical University, Suzhou Jiangsu 215002； Wuxi Clone Gen-Tech Institute, Wuxi Jiangsu 214026, China)

 

　　［Abstract］  Objective: To understand the resistance gene spectrum and genetics characteristics of Klebsiella pneumoniae(Kpn)  producting ESBLs.Methods： The genes including aac(3)-Ⅰ，aac(3）-Ⅱ， aac（6′）-Ⅱ，ant（3″）-Ⅰ，ant（2″）-Ⅰ，aac(6′)-Ⅰ，aac（6′）-Ⅰb，TEM，SHV，LEN，OKP，CTX-M-1，CTX-M-2， CTX-M-9，GES，PER，VEB，OXA-10，OXA-1，OXA-2，DHA，ACT-1，intI1, intI2，intI3，tnpA, merA, qnr，qacEΔ1-sul1  were analyzed by PCR. And Some products were sequenced.  Results： β-lactamase gene was found in 62.9％，AMEs gene was found in 74.3％，tnpA was all negative，Integron gene was found in 62.9％，merA was found in 5.7％，qnr was all negative，qacEΔ1-sul1 was found in 37.1％ in 35 Kpn. We found a new genotype and named as aac（6′）-Ⅰb-Suzhou，which we have registrated in NCBI(Login: EF375621). Conclusion： The carrying rates of resistance gene and disinfectant-resistant gene were very high，resistance gene spectrum and genetics characteristics of Kpn producting ESBLs were very complex.

 

　　［Key words］  Klebsiella pneumoniae； resistance gene; genetics characteristics

 

　　近年來肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae,Kpn）已成為醫院感染的重要病原菌。國家細菌耐藥監測網報告對8個省、市自治區的57家三級甲等醫院調查(2002年1～12月),Kpn菌分離率列第三位（占8.2%）。Kpn菌對β-內酰胺類和氨基糖苷類在內的常用抗菌藥物出現多重耐藥性［1］。新近國內盡管已有Kpn菌的耐藥基因研究報道，但所涉及基因種類不夠全麵［2-4］ 。為了解我院產ESBLs的Kpn菌(Kpn-ESBLs)氨基糖苷類修飾酶基因、β-內酰胺酶基因、喹諾酮類耐藥基因、消毒劑-磺胺耐藥基因以及整合子基因、轉座子基因存在狀況，我們對35株分離自患者的Kpn-ESBLs進行了29種基因的檢測，現報告如下。

 

　　1  材料與方法

 

　　1.1  菌株來源及鑒定　

　　35株Kpn-ESBLs均分離自2004年11月～2006年4月我院住院患者標本，分別為：痰液或氣管分泌物16份，血液16份,尿液3份。全部菌株均使用Walkaway-40細菌鑒定儀鑒定菌種。並根據美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI標準）確認為產ESBLs菌株。

 

　　1.2  抗菌藥物敏感性

　　35株Kpn-ESBLs 19種抗菌藥物的敏感性見表1。

　　表1  35株Kpn-ESBLs 19種抗菌藥物的敏感性（略）

 

　　Tab 1  19 kinds of antibiotics sensitivity of 35 Kpn-ESBLs

 

　　1.3  基因檢測　

　　聚合酶鏈反應法(PCR)檢測。PCR引物序列見表2。模板製備為蛋白酶K消化法。基因檢測試劑盒、靶基因PCR引物序列和陽性對照DNA由無錫市克隆遺傳技術研究所提供，完全按說明書操作。擴增產物作2%瓊脂糖凝膠電泳，紫外凝膠電泳成像儀下觀察，並記錄結果。

 

　　表2  PCR引物序列（略）

 

　　Tab 2  PCR primer sequences

 

　　2  結果

　　35株Kpn-ESBLs中檢出氨基糖苷類修飾酶基因陽性27株(77.1%)；β-內酰胺酶基因22株(62.9%)；喹諾酮類耐藥基因qnr全部陰性；消毒劑-磺胺耐藥基因qacEΔ1-sul1陽性13株(37.1%)；整合子基因陽性22株(62.9%)；轉座子基因merA 陽性2株(5.7%)、tnpA 全部陰性。表3為29種基因檢測結果。其中菌株號szey4536分離自2006年4月18日本院住院患者標本，為痰標本，檢出aac(6′)-Ⅰb耐藥基因，進行測序並與已在美國國立生物信息中心［NCBI］登錄的aac（6′）-Ⅰb基因家族序列比對，發現與已登錄的全部aac（6′）-Ⅰb基因序列均不同,為新的基因型並以aac(6′)-Ⅰb-Suzhou型命名登錄於美國NCBI(登錄號：EF375621)。圖1為該基因PCR產物測序圖。

　　表3  35株Kpn-ESBLs 29種耐藥基因檢測結果（略）

 

　　Tab 3  Results of 29 kinds of resistance genes of　35 Kpn-ESBLs

　　3  討論

　　國內尚無全麵的Kpn-ESBLs耐藥基因研究報道，本研究發現Kpn-ESBLs對β-內酰胺類和氨基糖苷類在內的常用抗菌藥物出現多重耐藥性。近年來，國內不斷有Kpn菌攜帶β-內酰胺酶基因的報道 ［3-9］，但氨基糖苷類修飾酶基因的報道鮮見。本組35株Kpn-ESBLs較為係統的β-內酰胺酶基因檢測顯示：blaTEM陽性18株(51.4%)，blaCTX-M-1 group陽性4株(11.4%)，blaCTX-M-9 group陽性4株(11.4%)、blaLEN陽性2株(5.7%)，blaDHA陽性6株(17.1%)、blaOXA-1 group陽性1株（2.9%），其餘9種β內酰胺酶基因均陰性，β-內酰胺酶基因總陽性率達到62.9%。氨基糖苷類修飾酶基因aac（3）-Ⅰ陽性4株（11.4%）、aac（3）-Ⅱ陽性7株（20%）、 aac（6′）-Ⅰ陽性13株（37.1%）、aac（6′）-Ⅱ陽性7株（20%）、ant（3″）-Ⅰ陽性11株（31.4%）、ant（2″）-Ⅰ陽性12株（34.2%）、aac（6′）-Ⅰb陽性12株（34.2%），總氨基糖苷類修飾酶基因陽性率高達77.1%，可見該類藥物耐藥情況非常嚴重。本文氨基糖苷類修飾酶基因檢出率高於耐藥率，這可能與經修飾鈍化後的抗菌藥物仍具有相當抗菌活性有關。本文發現的szey4536號菌aac（6′）-Ⅰb基因經比對與先前已在美國NCBI登錄的均不相同［10］(包括2006年初，美國學者發現的新氨基糖苷類修飾酶aac(6′)-Ⅰb-Cr型［11］),因此以aac(6′)-Ⅰb-Suzhou型命名，並已登錄在美國NCBI。氨基糖苷類修飾酶aac(6′)-Ⅰb-Suzhou新的基因型是否表達新的氨基糖苷類藥物修飾譜有待於進一步研究。

　　整合子是繼轉座子之後新發現的可移動基因元件, 整合子更易在同種細菌和不同種類細菌中進行基因的水平轉移,從而使細菌的耐藥性得以快速傳播［12］。耐消毒劑qacEΔ1與sul1基因為重疊基因, 本研究在qacEΔ1下遊設計引物P1, 在sul1上遊設計引物P2。PCR擴增陽性表示qacEΔ1與sul1基因同時存在。我院35株Kpn-ESBLs中qacEΔ1-sul1基因陽性13株(37.1%)，即我院三分之一左右的Kpn-ESBLs已攜帶耐消毒劑與磺胺基因。本研究發現Ⅰ類整合子基因（intⅠ1）陽性率較高，達60%，而Ⅱ,Ⅲ類整合子基因（intⅠ2，intⅠ3）陽性率較低，說明耐藥菌 Ⅰ類整合子攜帶率高，同時也是我國細菌臨床分離株耐藥性連年上升的重要原因。近年來大量文獻報道,覆有氯已定和磺胺的Ⅱ代導管能有效預防細菌定植和細菌生物膜形成［13-15］。氯已定與磺胺耐藥基因的高檢出率, 提示對Ⅱ代導管的抑菌效能需要再認識和再評價。

  作者：徐衛東，徐紅星， 糜祖煌，陳昭華, 吳元健

作者單位：南京醫科大學附屬蘇州市立醫院檢驗科，江蘇 蘇州 215002； 無錫市克隆遺傳技術研究所，江蘇 無錫 214026

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