幽門螺杆菌實驗室檢測與應用價值

【關鍵詞】  幽門螺杆菌；方法學；應用價值

 

　　1983年由澳大利亞醫生R·Warren和B·Marshall從胃黏膜組織中成功分離培養出幽門螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)以來,Hp與慢性活動性胃炎和消化性潰瘍以及在發病過程中的作用已得到證實。但Hp感染缺乏臨床表現特征，Hp感染診斷主要依靠實驗室檢測。Hp檢測技術日益完善和準確，方法從細菌形態學發展進入到Hp全基因序列測定分析階段。Hp感染檢測方法可分為：取胃黏膜標本檢測Hp，包括細菌培養、快速尿素酶試驗、組織塗片和切片染色；呼氣試驗和尿氨排出試驗檢測Hp；血清免疫學方法檢測Hp。根據檢測是否需做胃鏡檢查分為：直接檢測法，必須在胃鏡下取材，包括細菌培養、塗片染色、快速尿素酶試驗、活檢標本切片染色和多聚酶鏈反應等；間接檢測法，不需要胃鏡下取材，包括13 C、14 C呼氣試驗、15 N尿氨排出試驗和血清免疫學檢測等。Hp感染實驗室檢測的常用方法有：

 

　　1  微生物學方法

 

　　1.1  細菌培養法  從胃黏膜活檢標本中分離培養出Hp，再用形態學和生物化學方法鑒定，是診斷Hp感染最可靠的方法。Hp是微需氧菌，不能在大氣下和絕對厭氧條件下生長，它需要的氣體條件是N2 85%、CO2 10%、O2 5%，還需要有一定的濕度和較好的營養成分。Hp生長緩慢，形成的菌落細小，必須添加抑製雜菌生長的抗生素，才能提高Hp的檢出率。盡管Hp感染診斷的金標準是分離培養，但它需要一些特殊設備和試驗條件，國內尚未廣泛開展，至今隻有少數實驗室把它用於科研，而不作為常規檢測而用於臨床。

 

　　1.2  塗片檢測法  在胃鏡檢查時用細胞刷在胃黏膜表麵刷取黏液成分或取活檢標本直接塗片，經革蘭(Grams)染色，在光學顯微鏡下觀察，Hp呈Grams陰性，彎曲狀、弧狀、S形和C形，形態特征較明顯。塗片檢測Hp是一種簡單實用的方法,塗片標本未經任何處理不受外界因素影響，菌體保持完整，形態與生活時相仿。為簡便染色過程,Grams染色亦可簡化為石碳酸複紅單染法［1］，染色效果不比Grams染色遜色。還可采用相差顯微鏡直接觀察塗片檢測Hp和用吖啶橙染色，熒光顯微鏡觀察檢測Hp。

 

　　2  快速尿素酶試驗

　　

　　Hp產生尿素酶的能力強，尿素酶分解胃液中尿素生成NH3和CO2，快速尿素酶試驗用於胃鏡檢查中診斷有無Hp感染。試驗試劑包括尿素、pH指示劑(酚紅)、緩衝液和防腐劑。在酸性條件下，當pH值≤6.8時，酚紅指示劑呈黃褐色，如果活檢標本中有Hp存在，尿素酶分解尿素產生NH3使試劑pH值發生變化而升至≥8.4，這時酚紅指示劑由黃褐色變為紅或紫紅色。目前常用的尿素酶試劑在與胃鏡活檢標本接觸後幾分鍾後便可顯色，快速尿素酶試驗屬於間接試驗，標本大小、細菌多少、反應時間、溫度和濕度均可影響尿素酶試驗結果。尿素酶試驗具有快速、簡便的優點，特別適合基層醫院推廣使用。

 

　　3  同位素示蹤劑方法

　　

　　這類方法主要是采用讓患者口服同位素標記的尿素，利用Hp產生尿素酶能分解尿素的原理，以觀察胃中Hp分解尿素的能力，以此判斷患者是否感染了Hp及感染的程度，這類試驗現有兩類三種。Hp具有較強的內源性尿素酶，能分解胃內及核素標記的尿素，產生CO2和NH3,CO2被吸收後經肺呼出，分析呼氣中的13 CO2或14 CO2即可診斷Hp的存在。根據呼氣試驗類似的原理，15 N尿氨排出試驗是一種尿素在胃內分解後，15 N經吸收通過腎髒由尿排出的試驗，讓受試者口服穩定性同位素15 N標記的尿素，然後測定尿液中排出的15 NH3來判斷胃內Hp的感染情況。這類試驗方法屬於間接檢測，通過多次采集樣本後在儀器上進行測定分析。

 

　　3.1  呼氣試驗  呼氣試驗的原理是基於Hp產生大量的尿素酶，給感染Hp的患者口服同位素標記尿素溶液，則尿素被分解後產生同位素標記CO2由肺呼出。可收集呼氣樣本，用氣體同位素質譜儀或液體閃爍掃描儀檢測同位素標記CO2的量來檢測Hp。根據標記物的不同，分為13 C和14 C呼氣試驗。

 

　　3.1.1  13 C標記的尿素  用穩定性同位素13 C標記的尿素，讓患者口服後，尿素在胃中與Hp產生的尿素酶接觸後分解成13 CO2，測定其在總呼出量中所占的濃度，以判斷胃中是否感染了Hp和感染程度。這種方法的最大優點是：體內測定胃內感染Hp的總體情況，避免了活檢標本Hp分布不均造成的假陰性的結果；13 C是一種穩定性同位素，對機體無損傷；它除了定性以外，還可做定量測定。它的最大缺點是需用高精度氣體比值同位素質譜儀來測定，這種設備是一般醫院不具備的貴重儀器。

 

　　3.1.2  14 C標記的尿素  用14 C標記的尿素讓患者口服，用閃爍掃描儀測定患者呼出的14 CO2，這種儀器在有核醫學科的醫院一般都有，測定方法比較方便。盡管它的優點類似於13 CO2呼氣試驗，但是14C是一種放射性同位素，因此這項試驗對孕婦和小孩不宜使用。

 

　　3.2  尿氨排出試驗  15 N尿氨排出試驗是根據類似呼氣試驗原理創立的，其方法是用15 N標記尿素讓患者口服，然後收集2 h尿液檢出其15 N尿氨的排出率，以判斷胃內Hp感染程度。這一試驗具有13 CO2呼氣試驗同樣的優點，不需作胃鏡，無放射性損傷，采集樣本比呼氣試驗方便，測定準確性較高，缺點與13 C呼氣試驗相同，檢測需用氣體同位素質譜儀。由於15 N尿氨排出試驗是一種尿素在胃內分解後，15 N經吸收通過腎髒由尿排出的試驗，因此有嚴重肝腎功能損害者不宜使用。

 

　　4  血清學方法

　　

　　通過血清中Hp抗體測定Hp感染的方法比較多，有酶聯免疫吸附試驗(ELISA)、乳膠凝集試驗、免疫印跡試驗和細菌凝集試驗等，尤其以ELISA試驗應用最廣泛。Hp感染後會激發機體產生特異性體液免疫，血清中出現IgG、IgA、IgM抗體，常采用ELISA試驗檢測Hp IgG抗體。ELISA試驗是目前常用的方法，同時測定兩種免疫球蛋白能提高這一方法的敏感性。在進行ELISA試驗時，最重要的是抗原選擇，該試驗的敏感性雖高，但缺乏特異性，從而影響對試驗結果的判斷。要提高ELISA試驗的特異性和敏感性，則需要對抗原進一步純化，抗原則可獲得較高的特異性和敏感性。血清學方法簡便，成本較低，患者對采血進行檢測的方法比做胃鏡檢查更樂意接受。由於抗Hp抗體可長時間維持在陽性水平，至少需要6個月～12個月才能降到足以預測治療成功的程度，血清學方法便失去了原有的吸引力，但在流行病學調查中仍有它的應用空間。

 

　　5  多聚酶鏈反應

　　

　　多聚酶鏈反應(Polymerase chain reaction，PCR)實際上是一種核酸片段體外擴增試驗。做試驗的先決條件是首先必須清楚某一基因的核苷酸序列，然後人工合成其中兩個特異性片段作為引物，在PCR儀上經過30個～50個循環擴增其核酸片段，使其成倍增長，然後取其片段作瓊脂糖凝膠電泳，電泳後取出凝膠在紫外線燈下觀察結果，即可判斷所得產物是否為基因產物。目前亦可用這一反應來檢測標本中有無Hp的存在，甚至還可進一步用核苷酸序列分析或特異性探針加以鑒定。可是PCR高敏感性也有它致命的弱點，使用試劑濃度、操作溫度、過度擴增、極少DNA汙染等都可導致假陽性。嚴格控製，合理選擇DNA擴增循環次數，防止汙染，設置對照等都是不可忽視的因素。采用PCR技術在Hp診斷和評價治療後根治效果有意義，但對實驗室和試驗條件要求高，如果在非標準條件下進行檢測，有可能會出現懸殊的結果，特別是假陽性的大量出現。目前PCR技術不適合用於臨床檢測Hp感染。

 

　　6  組織切片染色法

 

　　6.1  胃黏膜活檢標本  病理組織切片染色檢測Hp是最常用的方法，活檢標本經石蠟包埋切片染色後，Hp在顯微鏡下形態特征是菌體2 μm～4 μm長，0.5 μm寬，Hp為弧形成螺旋狀彎曲樣細菌，定植於胃黏膜上皮細胞表麵、胃小凹和胃內腺腔中，常規HE染色憑Hp形態及定植部位可以識別。當Hp量少或有上皮細胞脫落時而難以辨認時，就需要采用其他組織化學染色方法來鑒別診斷，迄今沒有一種染色方法對Hp的顯示是特異的。顯示Hp的染色方法有：改良Warthin-Starry銀染色、改良Giemsa、堿性品紅、石碳酸複紅、亞甲藍、中性紅、甲苯胺藍、甲基紫、甲苯酚紫和吖啶橙染色等10餘種染色法。改良Warthin-Starry銀染色是經典的Hp染色方法［2］，Hp在黃色背景下呈現出黑色螺旋狀形態，該染色方法技術要求高，操作繁瑣，每次染色需加溫、恒溫及配顯影液，熱水衝洗等，若操作不當容易造成在切片上留下銀顆粒沉澱與Hp橫截麵形態相混淆的現象；改良Giemsa染色是一步雙色快速染色法，操作更為簡便，染色效果好，現已廣泛應用於常規檢測和科研中［3］，在顯微鏡下Hp染成淡藍色，菌體形態清楚，切片背景清晰，不但可觀察到Hp數量、侵入深度和分布情況，還能觀察到胃黏膜病理改變情況等；堿性品紅、石碳酸複紅、亞甲藍、中性紅、甲苯胺藍、甲基紫、甲苯酚紫染色都是單染法，操作簡便，染色時間短，菌體形態和切片背景呈一色性，當細菌量少時應與黏液成分認真區分；吖啶橙熒光染色，Hp呈淡橙紅色熒光，可以更好地辨別Hp的形態特征，尤其在Hp量少時優於Warthin-Starry和Giemsa染色，吖啶橙熒光染色簡便、快速，但需要熒光顯微鏡進行觀察；熒光抗體免疫組織化學方法也有人使用，不比組織化學染色方法有更多的優點。

 

　　6.2  Hp形態分布情況  通過組織化學染色顯微鏡下觀察，Hp呈單個散在或成團聚集，形態以螺旋狀、彎曲杆狀、球狀菌最常見，Hp在生存環境不利時易發生形態變異，球形變常見，短杆狀、長絲體、巨球體等形態亦可見到。根據Hp數量和分布密度進行半定量測定，將Hp感染分為4級：(-)：無特征性細菌；(+)：仔細尋找有細菌發現，數量較少，稀疏散在；(++)：有大量散在分布或成叢的細菌,數量較多，比較密集；(+++)：有大量的細菌，數量很多，聚集成團。Hp感染檢測方法應本著經濟、快速、準確、簡便、敏感、特異等原則，盡可能選擇最佳方法，以便實施和推廣。通過胃鏡檢查所取標本進行快速尿素酶試驗和病理組織切片Giemsa染色檢測Hp，是目前各級醫院診斷Hp感染最常用的檢測方法。

作者：胥維勇，楊 紅，楊 群，範小莉，何 娟 作者單位：四川省人民醫院，四川 成都 610072

【參考文獻】

  　　［1］ 胥維勇,楊紅,李科,等.應用塗片染色檢測幽門螺杆菌［J］.診斷病理學雜誌,2000，7(3):225.

　　［2］ 淩啟波.實用病理特殊染色與組化技術［M］.廣東高等教育出版社,1989:4245.

　　［3］ 楊紅,胥維勇,李科,等.改良Giemsa染色在幽門螺杆菌檢測的應用［J］.中國組織化學與細胞化學雜誌,1996，5(1):101.