微生物實驗室成功地進行細菌菌種保存，對於係統地分析流行菌株的生物學、分子生物學特征和耐藥性的變遷，以及對醫院感染病原學調查、新藥臨床研究都十分重要［1］。我們通過對1998年1月～2000年5月兩年多時間冰凍保存的VITEK-GNI、GPI、YBC 3種生化鑒定卡共4 700株常見的細菌，選擇其中258株常見進行複活再鑒定，以探討一種操作簡便而又實用可靠的保存臨床標本分離細菌菌株的方法，現報道如下。
一、材料和方法
1.標本來源：258株1998年1月～2000年5月從痰、血、尿、膿液等標本中分離、純培養的細菌，用VITEK全自動微生物分析儀分析後，其GNI、GPI、YBC生化卡當日即按流水號順序置-20 ℃冰箱保存。
2.儀器：VITEK全自動微生物分析儀及配套生化卡、藥敏卡。生物梅裏埃公司。
3.方法：把3種鑒定卡直接從-20℃移至35℃，待小孔液體完全融化後，以無菌手續，用注射器抽吸出陽性生長孔內的液體，點種於血平板或沙保弱平板，置35℃孵箱內24～48 h複蘇。複蘇菌落經分離培養後，用VITEK係統對菌株進行鑒定和藥敏試驗，以金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922、綠膿假單胞菌ATCC27853作質控。
二、結果
1.菌株複活率：258株細菌按初始鑒定的結果，以伯傑細菌分類為依據，歸納為葡萄球菌屬、鏈球菌屬、腸杆菌科、腸球菌屬、假單胞菌屬、黃杆菌屬、不動杆菌屬、念珠菌屬8大類。各類菌屬的細菌100%的存活時間：葡萄球菌屬、腸杆菌屬、念珠菌屬為29個月，腸球菌屬、黃杆菌屬、不動杆菌屬為21個月，鏈球菌屬和假單胞菌屬為10個月。
2.生物學特性及耐藥譜變化：258株細菌中共218株複活成功，複活菌株的培養特點、形態特征、生化特性均與初始鑒定結果一致，細菌的凍融複活前後藥敏譜也基本一致，符合率為93.7%～100%。
3.反複凍融的影響：從複活的各類菌株中選取30株的生化卡反複凍融5次，每次冰凍的時間保持24 h以上。結果30株細菌5次凍融均複活成功，且其生物學特性及耐藥譜未發生明顯的變化，證實多次凍融對細菌的保存無影響。
4.與半固體菌種保存法的比較：用鑒定卡和半固體菌種培養基同時保存12株臨床分離菌及3株ATCC25922、ATCC25923、ATCC27853標準菌株6個月對照，其中半固體中的菌株定時轉種傳代。結果兩種方法保存菌株的生物學特性均一致。
三、討論
菌株保存得不成功容易引起菌株的生物學特征改變，甚至是耐藥質粒的丟失而改變細菌的耐藥譜，某些敏感菌株與抗生素結合位點發生突變而形成耐藥［2，3］。根據對258張VITEK生化卡的凍融複活再分析，使我們成功地找到一種利用廢棄的VITEK鑒定卡作為臨床分離菌株的菌種保存方法，既不需要特殊設備，又不受反複轉種影響，因而其生物學特性不易發生變異，細菌的耐藥譜也基本保持不變。
隨著全自動微生物分析儀的普及應用，該方法可適合於常規工作的大量菌種保存的應用。對VITEK生化卡內的細菌反複凍融5次，分離出的細菌效果是相同的，證實保存在生化卡上的菌種可進行多次複活利用，為了保證每次都能成功地複蘇獲得菌株，我們通過試驗發現，生化卡上的試驗小孔除陽性控製小孔外，其它糖類發酵孔內的細菌均能複活成功，其結果無差異。由於快速複溫對細菌的損傷力小［4］，為了保證菌株獲得最大的成活率，我們認為對鑒定卡複融應采取由-20直接放35℃孵箱。
作者：孫明洪 陳麗英 呂火祥 劉建棟 沈蓓瓊 俞曉潔 《中華醫學檢驗雜誌》
參考文獻
1，張秀珍，主編. 當代細菌檢驗與臨床. 北京：人民衛生出版社,1999. 401-446.
2，Chambers HF, Sachdeva MJ, Hackbarth CJ. Kinetics of pencilin binding to penicillin-binding proteins of Stophylococcus aureus. Biochem J, 1994,301:885-891.
3，王清濤，杜小玲，曲壽山，等. 金黃色葡萄球菌耐藥性分析. 中華醫學檢驗雜誌，1997,20:275.
4，章崧英，王澤時，鄭斯通，主編. 實用低溫學. 北京：科學出版社，1994.73-77.
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