幽門螺杆菌相關性胃炎中核因子κB與IL8表達的意義及關係

Expression of NFκB and interleukin8 in helicobacter pyloriassociated gastritis

 

　　CAO Ping, LU QiMing, ZHANG XiuLan

 

 

　　1School of Clinical Medicine, Lanzhou University, 2Department of Gastroenterology, Peoples Hospital of Gansu Province, Lanzhou 730000, China

 

 

　　【Abstract】 AIM: To investigate the relation and distribution of expressions of nuclear factorκB (NFκB) p65 protein and interleukin8 (IL8) in helicobacter pyloriinfected gastric mucosa. METHODS:  Gastric mucosal biopsy specimens were obtained respectively from 38 patients with H.pyloripositive gastritis and 18 H.pylorinegative control subjects. The expressions of NFκB p65 protein, IL8 mRNA and protein were determined by immunohistochemistry and in situ hybridization. RESULTS:  The expressions of p65 protein, IL8 mRNA and protein were significantly higher in H.pyloripositive gastric mucosa than those in H.pylorinegative controls (5.7±3.3 vs 3.0±2.5, 3.7±2.6 vs 1.1±1.3, 4.0±3.0 vs 1.9±1.6, P<0.01) and they were correlated with the histological severity of activity, inflammation and H.pylori density (P<0.05). The expression of p65 significantly was correlated with that of IL8 mRNA and protein (P<0.01). There was a positive correlation between IL8 mRNA and IL8 protein (P<0.01). CONCLUSION:  H.pylori infection leads to the overexpression of NFκB p65 and IL8 in the gastric mucosa. NFκB activation may contribute to IL8 gene transcription and is involved in the pathological process of H.pyloriassociated gastritis.

 

 

　　【Keywords】 nuclear factorκB; interleukin8; Helicobacter pylori;  chronic gastritis

 

 

　　【摘要】 目的：探討幽門螺杆菌（Helicobacter pylori, H.pylori）感染時胃黏膜中核因子κB（NFκB）和白細胞介素8（IL8） mRNA及蛋白的表達關係和分布. 方法： H.pylori陰性慢性胃炎18例和H.pylori陽性慢性胃炎患者38例，胃黏膜活檢標本采用免疫組化法和原位雜交法檢測NFκB p65蛋白、IL8 mRNA及蛋白的表達. 結果：H.pylori陽性慢性胃炎組胃黏膜中NFκB p65蛋白、IL8 mRNA和蛋白的表達較H.pylori陰性組顯著增強（5.7±3.3 vs 3.0±2.5, 3.7±2.6 vs 1.1±1.3, 4.0±3.0 vs 1.9±1.6, P<0.01），三者的表達均與胃黏膜慢性炎症程度密切相關（rs分別為0.536,0.474和0.537, P<0.01），與炎症活動性也呈正相關（rs分別為0.575,0.357和0.469, P<0.05），同時與H.pylori密度之間具有顯著相關性（rs分別為0.702,0.614和0.713, P<0.01）； p65蛋白表達與IL8 mRNA和蛋白的表達均呈正相關關係（rs分別為0.666,0.682，P<0.01）. 結論：H.pylori感染導致胃黏膜NFκB p65和IL8的表達增加，NFκB可能通過調控IL8基因轉錄，參與了H.pylori相關性胃炎的病理生理過程.

 

 

　　【關鍵詞】 核因子κB；白細胞介素8；幽門螺杆菌；慢性胃炎

 

 

　　0引言

 

 

　　核因子κB（nuclear factorκB, NFκB）是一類具有多向性轉錄調節作用的核蛋白因子，廣泛參與多種基因特別是免疫炎症反應相關基因的表達調控，在機體的免疫應答、炎症反應、細胞生長分化和凋亡等方麵發揮著重要作用［1-4］. 已知白細胞介素8（interleukin8,IL8）是幽門螺杆菌（Helicobacter pylori, H.pylori）相關胃炎症反應的主要介質［5,6］，因此我們在原位觀察H.pylori相關性胃炎胃黏膜中核因子κB p65蛋白和IL8 mRNA及蛋白的表達和細胞定位，並分析它們之間的關係，探討NFκB在H.pylori致病機製中的作用.

 

 

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　經胃鏡及病理組織學檢查證實的慢性胃炎56(男35，女21)例，年齡18～70（平均41）歲，其中H.pylori陰性18例，H.pylori陽性38例. H.pylori診斷采用快速尿素酶試驗和改良Giemsa染色，2項結果均陽性診斷為H.pylori陽性，2項結果均陰性診斷為H.pylori陰性，一陰一陽不列入本研究. 兩組間在性別、年齡的構成上無顯著性差異，所有研究對象受檢前4 wk內均未接受抗生素、鉍劑、H2受體拮抗劑、質子泵抑製劑和糖皮質激素治療. 內鏡檢查時每例研究對象均於距幽門2~3 cm胃竇大小彎取活檢標本4塊，1塊用於快速尿素酶試驗，另3塊用於病理組織學檢測、免疫組織化學染色和原位雜交染色，內鏡活檢標本經甲醛固定石蠟包埋，4 μm厚度連續切片備用，作常規HE染色和改良Giemsa染色以確定病理組織學和H.pylori診斷. 根據悉尼係統胃炎分類標準，將慢性炎症、活動性、萎縮、腸化和H.pylori密度分別分成0，1，2，3級.  鼠抗人NFκB p65 mAb和兔抗人IL8多克隆抗體購自美國Santa Cruz公司;免疫組織化學染色試劑盒（SP即用型）、DAB顯色劑和檸檬酸抗原修複液購自福州邁新公司;IL8 mRNA原位雜交試劑盒和焦碳酸二乙酯購自武漢博士德公司.

　　1.2方法

　　免疫組織化學染色的組織切片脫蠟至水後，微波修複抗原，繼以免疫組化SP法染色（步驟按說明書進行），DAB顯色，蘇木素複染，封片. 一抗工作液稀釋濃度為：NFκB p65 1∶100；IL8 1∶200. 用PBS替代一抗作陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照. 原位雜交染色的組織切片脫蠟至水，30 mL/L H2O2室溫處理10 min以滅活內源性酶；胃蛋白酶消化10 min，暴露核酸片段；滴加預雜交液，40℃ 4 h；加IL8寡核苷酸探針雜交液，40℃雜交過夜；加封閉液37℃ 30 min；滴加生物素化鼠抗地高辛37℃ 60 min；加SABC 37℃ 20 min；滴加生物素化過氧化物酶37℃ 20 min；DAB顯色，蘇木素複染，封片. 用預雜交液替代探針作陰性對照. 以胞質或胞核出現棕黃色顆粒為NFκB p65陽性表達細胞，以胞質出現棕黃色顆粒為IL8 mRNA和蛋白陽性表達細胞. 每張切片隨機觀察10個高倍視野，采用統一的染色積分評價標準，按染色強度分為4級：0,陰性染色;1,弱陽性染色;2,中度陽性染色;3,強陽性染色；按陽性細胞數占總細胞數的比例分為5級：0,陰性;1,陽性細胞占1%～25%;2,陽性細胞占26%～50%;3,陽性細胞占51%～75%;4,陽性細胞占76%～100%. 每張切片的染色積分以這二者乘積之和表示.

　　統計學處理： 染色積分以x±s表示，應用SPSS 10.0統計分析軟件包進行統計學處理，采用秩和檢驗和Spearman等級相關分析，P<0.05認為差異有統計學意義.

　　2結果

　　2.1NFκB p65蛋白和IL8 mRNA及蛋白的細胞定位p65蛋白主要表達於胃竇黏膜表麵上皮和固有腺上皮細胞，亦散在表達於固有層炎性細胞（主要為單核細胞和淋巴細胞），且在H.pylori陰性胃黏膜中陽性染色主要在胞質中，少數有胞核著色，而H.pylori感染胃黏膜中則胞質胞核均有陽性染色，與H.pylori陰性組比較胞核著色明顯增加. IL8 mRNA和蛋白均表達在胃竇黏膜表麵上皮和固有腺上皮細胞以及固有層單核細胞的胞質中.

 

 

　　2.2H.pylori感染與胃黏膜NFκB p65蛋白、IL8 mRNA和蛋白表達的關係H.pylori陽性胃黏膜中NFκB p65蛋白、IL8 mRNA和蛋白的表達較H.pylori陰性組顯著增強(P<0.01，Tab 1)，且三者的表達均與H.pylori密度之間具有明顯相關性（rs分別為0.702,0.614和0.713, P<0.01）.表1兩組患者胃黏膜NFκB p65蛋白、IL8 mRNA和蛋白表達的比較（略）

　　2.3H.pylori陽性胃黏膜NFκB p65蛋白、IL8 mRNA和蛋白表達與胃黏膜炎症程度的關係NFκB p65蛋白、IL8 mRNA和蛋白的表達與胃黏膜慢性炎症程度密切相關（rs分別為0.536,0.474,0.537，P<0.01），同時也與炎症活動性的程度呈正相關（rs分別為0.575,0.357和0.469，P<0.05），但與萎縮和腸化的程度無相關性(Tab 2).表2NFκB p65蛋白、IL8 mRNA和蛋白表達與胃黏膜炎症程度的關係（略）

　　2.4H.pylori陽性胃炎黏膜中NFκB p65蛋白、IL8 mRNA和蛋白表達之間的關係經Spearman等級相關分析發現，胃黏膜NFκB p65蛋白表達與IL8 mRNA和蛋白的表達均呈正相關關係(rs分別為0.666,0.682，P<0.01)，IL8 mRNA與其蛋白的表達亦顯著相關(rs為0.586，P<0.01).

 

 

　　3討論

 

　　我們發現，H.pylori陽性慢性胃炎組胃黏膜中NFκB p65表達較H.pylori陰性組明顯增強，且p65蛋白胞核著色較H.pylori陰性者明顯增多，提示H.pylori感染誘導和激活胃黏膜NFκB，使其移位到核，發揮轉錄調節功能. 此外，胃黏膜NFκB的表達與慢性炎症和活動性的程度相關，表明NFκB的誘導激活與H.pylori相關性胃炎的發生發展密切相關. Isomoto等［7］和Gijs等［8］的研究結果亦支持此觀點. 已知IL8是胃黏膜上皮細胞暴露於H.pylori後分泌的強有力的中性粒細胞和淋巴細胞趨化激活因子，在H.pylori免疫致病機製中起重要作用. 我們的研究表明，H.pylori感染使胃黏膜中IL8 mRNA和蛋白的表達明顯增強，並與胃炎的活動度、炎症程度及H.pylori密度均顯著相關.  IL8基因序列上含有NFκB的結合位點，細胞中NFκB的激活可導致IL8基因轉錄增加 ［2］.  本研究顯示，在H.pylori陽性胃炎黏膜中NFκB表達水平與IL8 mRNA和蛋白的表達均呈正相關關係，因此我們推測NFκB可能通過調控炎性細胞因子IL8基因轉錄，參與了H.pylori的致病過程,且在其中占據重要地位. 總之，NFκB在H.pylori相關性胃炎發病中的作用正日益受到關注，為我們提供了一個抗H.pylori所致炎症的設計思路，即通過抑製NFκB的活性以抑製炎症的強度. 目前體外實驗已證實［9,10］，NFκB抑製劑(如PDTC,p65和p50的反義寡脫氧核苷酸)在阻斷H.pylori誘導的NFκB活化的同時，也使胃上皮細胞分泌的炎性細胞因子減少. 因此我們有理由相信，通過幹預NFκB活性來改善H.pylori相關性胃炎治療的效果是一個可行的方法.

 

作者：曹萍，盧啟明，張岫蘭   第四軍醫大學學報 2005 年 8 月 第 25 卷 第 15 期

 

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